楸樹(shù)無(wú)糖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)初探

張 蕊， 石 娜， 孫玲凌， 李 藝

(周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧工程學(xué)院，河南周口 466000)

我國(guó)自20 世紀(jì) 70 年代開(kāi)展植物組織培養(yǎng)研究以來(lái)，組培技術(shù)在觀賞植物研究中得到了廣泛的應(yīng)用，為優(yōu)質(zhì)植物苗木的繁育和工廠化苗木的生產(chǎn)提供了可靠技術(shù)。但由于組培苗技術(shù)存在培育周期長(zhǎng)、對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求高、培養(yǎng)過(guò)程易污染、組培苗移栽成活率低等不足，使組培技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用受到一定限制。20世紀(jì)80年代末日本學(xué)者古在豐樹(shù)教授提出了無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)，人工控制培養(yǎng)條件，特別是在高濃度CO和高光照度的條件下，利用植物自身光合作用合成的碳源為植物自身的生長(zhǎng)提供有機(jī)物質(zhì)，而去除培養(yǎng)基中的糖類(lèi)物質(zhì)，因此減少了培養(yǎng)基污染的機(jī)會(huì)，因而能在開(kāi)放條件下進(jìn)行培養(yǎng)。由于無(wú)糖組織培養(yǎng)技術(shù)中植物的生長(zhǎng)環(huán)境更接近自然環(huán)境，因而無(wú)糖組培苗移栽減少了訓(xùn)化時(shí)間，縮短了育苗周期，并提高了移栽成活率。目前國(guó)內(nèi)外在棗、核桃、毛白楊、棕櫚、咖啡、桉樹(shù)、葡萄、萬(wàn)年青等植物上都有報(bào)道。

植物光自養(yǎng)微繁培養(yǎng)苗木需要特殊的容器，操作要求相對(duì)嚴(yán)格，投資成本較高，目前主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室范疇，生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用較??；目前關(guān)于楸樹(shù)組培技術(shù)的報(bào)道較多，但國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于楸樹(shù)的無(wú)糖組培技術(shù)報(bào)道。本試驗(yàn)以周楸帶葉柄葉片為外植體，研究葉柄部位在不同光照度、基本培養(yǎng)基和外源激素下誘導(dǎo)生根和腋芽再生植株的最適培養(yǎng)條件，在近常規(guī)環(huán)境下利用葉片進(jìn)行根誘導(dǎo)和植株再生，旨在為楸樹(shù)優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)技術(shù)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試楸樹(shù)葉片采集于河南省周口市河南花博士花卉有限公司楸樹(shù)種植基地。

試驗(yàn)于2020年5月5日在基地采集發(fā)育成熟、生長(zhǎng)健壯的功能期葉片，用鋒利的刀片徒手沿葉柄基部將葉片從母株上切割下來(lái)，切割下來(lái)的葉片要完整，保留葉片和葉柄及葉柄基部部分木質(zhì)部組織，同時(shí)要注意保留葉柄基部的腋芽，然后對(duì)離體材料的葉柄進(jìn)行處理使分生組織外露；將葉片及葉柄在自來(lái)水下沖洗5min，然后用蒸餾水反復(fù)沖洗，70%乙醇浸泡30 s后，接種到種子發(fā)芽盒中進(jìn)行水培培養(yǎng)；2020年6月14日栽培到容器中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)光照度設(shè)2個(gè)水平：3 000、5 000 lx；Hogland培養(yǎng)液濃度設(shè)2種水平：1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)、細(xì)胞分裂素(6-BA) 分別設(shè)4個(gè)水平：NAA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)；6-BA(0、0.2、0.4、0.8 mg/L)共計(jì)64個(gè)處理。

試驗(yàn)在普通組培室進(jìn)行，所用種子發(fā)芽盒為 13×19×12 cm透明塑料種子發(fā)芽盒，每個(gè)處理培養(yǎng)葉片10張，每盒2張葉片；水培培養(yǎng)介質(zhì)為高密度無(wú)土栽培水培植物專(zhuān)用泡沫板。

接種前對(duì)組培室進(jìn)行紫外線(xiàn)滅菌處理，種子發(fā)芽盒、自封袋和泡沫板進(jìn)行紫外線(xiàn)處理后，再用無(wú)水乙醇處理30 min。所用培養(yǎng)液進(jìn)行高壓滅菌處理。培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，光照時(shí)間為10 h/d，12絲自封袋密封保濕培養(yǎng)3 d，然后打開(kāi)自封袋口培養(yǎng)，待組培苗生根后去除自封袋，在開(kāi)放環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)，生根后移栽到容器中培養(yǎng)為獨(dú)立植株。

1.3 觀察記錄與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

5 d后觀察愈傷組織、根系、腋芽形成及生長(zhǎng)情況，記錄開(kāi)始生根時(shí)間，培養(yǎng)40 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根率、腋芽高度、植株干質(zhì)量和愈傷組織黏化葉片數(shù)目：計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)全部試驗(yàn)處理生根情況，然后計(jì)算生根率；腋芽高度為植株基部至主莖頂部的距離，測(cè)量全部試驗(yàn)處理已發(fā)芽的植株高度，然后計(jì)算不同光照度(3 000、5 000 lx)、不同培養(yǎng)液濃度(1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素)條件下植株的平均高度；植株干質(zhì)量測(cè)定為隨機(jī)抽取1個(gè)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的試驗(yàn)處理(NAA 0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L)，然后分別統(tǒng)計(jì)該處理在不同光照度(3 000、5 000 lx)、不同培養(yǎng)液濃度(1/2Hogland+1%大蒜素、1/4Hogland+1%大蒜素)條件下，去除葉柄后的再生植株的干質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照度對(duì)楸樹(shù)葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

光照為綠色植物光合作用提供能源，是植物進(jìn)行光合作用的必要條件，在光照度達(dá)到光飽和點(diǎn)之前，隨著光照度增加，光合速率提高，大多數(shù)木本植物陽(yáng)生葉片光補(bǔ)償點(diǎn)為1.0～1.5 klx，光飽和點(diǎn)為20～50 klx。從表1可以看出，楸樹(shù)離體葉片在光照度5 000 lx時(shí)葉片的生根率、腋芽高度和再生植株干質(zhì)量均高于處理3 000 lx，但差異不顯著。

表1 光照度對(duì)楸樹(shù)葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

肉眼觀察比較不同光照度下根系和腋芽生長(zhǎng)情況亦無(wú)顯著差異，盡管高光強(qiáng)可以提高楸樹(shù)葉片的光合速率，為楸樹(shù)植株再生合成更多有機(jī)物質(zhì)，但試驗(yàn)結(jié)果表明，光照度3 000 lx條件下植物光合作用合成的有機(jī)物即可滿(mǎn)足楸樹(shù)葉片植株再生需求。

2.2 不同濃度培養(yǎng)液對(duì)楸樹(shù)葉片生根率、腋芽高度和植株干質(zhì)量的影響

離體楸樹(shù)葉片維持生存并進(jìn)行植株再生，需要利用葉柄從培養(yǎng)液吸收水分和所必需的礦物質(zhì)來(lái)參與調(diào)節(jié)生命活動(dòng)。從表2可以看出，離體楸樹(shù)葉片對(duì)培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽要求濃度較低，其生根率和植株干質(zhì)量在1/4 Hogland培養(yǎng)液濃度下表現(xiàn)均優(yōu)于1/2Hogland培養(yǎng)液，但二者無(wú)顯著差異。在1/2 Hogland培養(yǎng)液中，愈傷組織褐化或發(fā)黏個(gè)體數(shù)比較多，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢甚至停止，愈傷組織遲遲不生根，而進(jìn)一步影響葉片植株再生；1/2 Hogland培養(yǎng)液中黏化比例達(dá)15.00%，1/4 Hogland培養(yǎng)液中黏化比例則為8.13%，2種不同濃度培養(yǎng)液中愈傷組織黏化植株數(shù)目差異顯著(表2、圖1)。

表2 不同培養(yǎng)液濃度對(duì)楸樹(shù)葉片生根率、植株干質(zhì)量和愈傷組織黏化的影響

2.3 不同組合外源激素對(duì)楸樹(shù)葉片生根時(shí)間、生根率和腋芽高度的影響

由表3可知，當(dāng)培養(yǎng)液中不含NAA，外源激素 6-BA 含量為0～0.4 mg/L時(shí)， 楸樹(shù)葉片生根率和腋芽高度均隨著6-BA濃度的增加而增加；隨著培養(yǎng)液中NAA濃度的增加，楸樹(shù)葉片生根和生長(zhǎng)所需最適的6-BA濃度逐漸降低。培養(yǎng)液中NAA與 6-BA 不同組合中，NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L和NAA 0.4 mg/L+6-BA 0 mg/L 3個(gè)處理中，植株生根率可達(dá)90%及以上；腋芽高度在NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L及NAA 0.2 mg/L、NAA 0.4 mg/L與6-BA不同濃度組合的處理中均表現(xiàn)較好長(zhǎng)勢(shì)，植株高度均在 3.00 cm 以上。

表3 不同組合外源激素對(duì)楸樹(shù)葉片生根率和腋芽高度的影響

從表4可知，在楸樹(shù)葉片培養(yǎng)中，NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.2 mg/L組合，愈傷組織培養(yǎng)5 d出現(xiàn)，出現(xiàn)早且生長(zhǎng)快，提高NAA濃度，愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間反而較晚；NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L 組合和NAA 0.4 mg/L+6-BA 0 mg/L 組合最早生根，低濃度NAA培養(yǎng)液中，愈傷組織需要較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)才能生根。

表4 不同組合外源激素對(duì)楸樹(shù)葉片愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間和生根時(shí)間的影響

培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在較低NAA和適當(dāng)6-BA的條件下，離體楸樹(shù)葉片往往先長(zhǎng)出腋芽，而后生根形成植株(圖2)。當(dāng)培養(yǎng)液中NAA濃度較高而 6-BA 濃度較低時(shí)生根則更容易(圖3)。

2.4 移栽條件及管理措施

將培養(yǎng)40 d生根的離體楸樹(shù)葉片移栽到園土 ∶草炭土=4 ∶1的基質(zhì)中，然后室外遮陰培養(yǎng)，白天由于氣溫高、天氣炎熱要注意多人工灑水降溫、增加空氣濕度。移栽時(shí)可帶腋芽移栽，腋芽直接發(fā)育成植株(圖4-a)；移栽時(shí)如切去腋芽，在移栽后3 d左右陸續(xù)發(fā)芽，且誘導(dǎo)芽發(fā)育整齊，生長(zhǎng)快(圖4-b)。

3 討論與結(jié)論

具有一定面積含有葉綠素的葉片能獨(dú)立進(jìn)行光合作用，從而合成植物生長(zhǎng)所需的有機(jī)化合物。無(wú)糖組培利用綠色植物通過(guò)光合作用合成植物生長(zhǎng)所必需的碳水化合物，在光合速率達(dá)到飽和前，光照度制約光合作用，通常2 000～3 000 lx的光照度可滿(mǎn)足外植體光合作用和對(duì)光通量的需求，如周鍾信等在對(duì)非洲菊再生小莖芽無(wú)糖組培培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，2 800、8 000 lx光照度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯影響，認(rèn)為過(guò)度提高光照度會(huì)因過(guò)多消耗而提高育苗成本。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離體楸樹(shù)葉片培養(yǎng)40 d時(shí)的生根率、再生腋芽株高及再生植株的干質(zhì)量在 5 000 lx 條件下高于3 000 lx，但差異不顯著，表明光照度在3 000 lx下，離體楸樹(shù)葉片合成的碳水化合物等有機(jī)物即可以滿(mǎn)足植株再生的要求，這可能與楸樹(shù)葉片為發(fā)育成熟的葉片，光合面積比較大、光合效率較高，組培室采光比較好，培養(yǎng)環(huán)境更接近自然光照條件有關(guān)。這為下一步研究如何更有效地利用人工光源對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行補(bǔ)光，楸樹(shù)葉片培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收利用及光周期對(duì)根和芽誘導(dǎo)的影響提供了一定的思路。葉片的光合作用不僅能為芽、莖、切口發(fā)育源源不斷地提供碳水化合物，而且葉片自身產(chǎn)生的內(nèi)源激素及其他生根促進(jìn)物，更有利于楸樹(shù)離體葉片發(fā)育成再生植株。

土壤中的礦質(zhì)元素必須溶于水才能被植物根系吸收，在植物組織培養(yǎng)中常用瓊脂作為支撐材料，因其透氣性和營(yíng)養(yǎng)元素移動(dòng)性差等原因而造成組培苗根系發(fā)育慢。采用塑料泡沫、巖棉、蛭石、珍珠巖等多空材料代替瓊脂等凝膠類(lèi)物質(zhì)可通過(guò)改善根系生長(zhǎng)環(huán)境而促進(jìn)根系和組培苗的生長(zhǎng)，同時(shí)固體基質(zhì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的濃度具有一定的緩沖作用，營(yíng)養(yǎng)元素通過(guò)水分逐漸被植物根系吸收一部分，而大部分會(huì)隨著水分流失；而水培能極大地節(jié)約人工，勞動(dòng)強(qiáng)度小，避免營(yíng)養(yǎng)元素流失，更適合立體栽培。本試驗(yàn)采用Hogland培養(yǎng)液，研究發(fā)現(xiàn)盡管離體楸樹(shù)葉片的生根率和再生植株干質(zhì)量在2種不同濃度的培養(yǎng)液條件下無(wú)顯著差異，但在1/2Hogland培養(yǎng)液條件下，離體楸樹(shù)葉片愈傷組織黏化植株的數(shù)量高于1/4Hogland培養(yǎng)液，差異達(dá)顯著水平，這可能與培養(yǎng)液中離子濃度過(guò)高有關(guān)。培養(yǎng)液中的各種營(yíng)養(yǎng)元素全部溶解在水中，能及時(shí)被植物吸收利用，但在培養(yǎng)期間如果培養(yǎng)液中離子濃度超過(guò)植物器官忍耐程度，就會(huì)對(duì)新生長(zhǎng)的愈傷組織產(chǎn)生毒害；同時(shí)由于楸樹(shù)葉面積比較大，對(duì)于N、P、K、Mg等易移動(dòng)元素，可被運(yùn)輸?shù)缴L(zhǎng)中心而被重復(fù)利用，能較大地滿(mǎn)足再生植株生長(zhǎng)需要，所以在試驗(yàn)中1/4Hogland培養(yǎng)液綜合優(yōu)于1/2Hogland培養(yǎng)液，且節(jié)約了成本，避免資源浪費(fèi)。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和分化中起重要作用，同一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的不同濃度及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化會(huì)產(chǎn)生不同影響，NAA 和6-BA不同濃度及 6-BA/NAA 不同比值在楸樹(shù)常規(guī)組培的近年研究報(bào)道較多。楊燕從篩選楸樹(shù)各種外植體入手，發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L NAA對(duì)楸樹(shù)無(wú)菌苗誘導(dǎo)生根效果最好；高濃度6-BA和高比值6-BA/NAA條件下形成的愈傷組織質(zhì)地緊密，但易褐變；低濃度 6-BA 和低比值6-BA/NAA條件下形成的愈傷組織質(zhì)地疏松，不易褐變，且容易分化不定根。楸樹(shù)無(wú)糖組培培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)NAA為 0.1 mg/L，同時(shí)6-BA為 0.2 mg/L時(shí)，離體楸樹(shù)葉片的葉柄愈傷組織出現(xiàn)最早，繼續(xù)提高NAA 和6-BA濃度，愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間反而推遲，表明較低生長(zhǎng)素和適當(dāng)細(xì)胞分裂素的條件下更加適合愈傷組織分化與生長(zhǎng)。而相反當(dāng)培養(yǎng)液中不含6-BA，NAA濃度為0.2、0.4 mg/L時(shí)，離體楸樹(shù)葉片的葉柄最早出現(xiàn)不定根，表明較高生長(zhǎng)素濃度和較低的細(xì)胞分裂素濃度時(shí)愈傷組織生根更容易。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果表明，楸樹(shù)無(wú)糖組織培養(yǎng)過(guò)程中所需NAA 和6-BA濃度比常規(guī)組織培養(yǎng)中所需濃度低，這可能與離體葉片能夠合成部分內(nèi)源激素有關(guān)，這為下一步對(duì)楸樹(shù)離體葉片無(wú)糖組織培養(yǎng)內(nèi)源激素及生理生化物質(zhì)變化研究明確了方向。

楸樹(shù)葉片誘導(dǎo)植株移栽后，去除原有腋芽的再生植株生長(zhǎng)速度要快于保留腋芽的再生植株，且去除腋芽的再生植株的生長(zhǎng)整齊度高，這可能與切去腋芽更有利于根系發(fā)育有關(guān)。腋芽的去除減少了地上部分營(yíng)養(yǎng)成分的消耗，減輕了移栽初期根系的負(fù)擔(dān)，有益于移栽初期根系的發(fā)育。

綜上所述，本研究通過(guò)試驗(yàn)從2個(gè)光照度、2個(gè)Hogland培養(yǎng)液濃度、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA和6-BA 16個(gè)不同濃度組合的64個(gè)處理中篩選出較佳培養(yǎng)條件：3 000 lx、1/4Hogland、NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.4 mg/L、NAA 0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L。該培養(yǎng)方法可以在開(kāi)放環(huán)境中進(jìn)行，利用離體楸樹(shù)葉片水培培養(yǎng)再生植株，操作流程簡(jiǎn)化，節(jié)約成本，縮短了育苗周期，可為楸樹(shù)育苗生產(chǎn)技術(shù)提供一種新的方法。