耐藥蛋白NDM-1的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法研究

賈良曦，楊柳，丁亞芳，邢維維，馬立才

(北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095)

隨著微生物與人類(lèi)的不斷斗爭(zhēng)，在抗菌藥物的使用過(guò)程中無(wú)可避免的會(huì)有“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)[1]。所謂的“超級(jí)細(xì)菌”并不僅僅單指一種細(xì)菌的名稱，而是一類(lèi)幾乎對(duì)所有抗生素都有強(qiáng)勁耐藥性的細(xì)菌統(tǒng)稱。新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase, NDM) 是一種新型的碳青霉烯酶，于2009年首次從印度新德里一名患者體內(nèi)的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中分離得到[2]。由于該類(lèi)細(xì)菌對(duì)包括碳青霉烯類(lèi)藥物在內(nèi)的所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物均耐藥，且攜帶耐氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素基因，導(dǎo)致其感染治療十分困難，因此也被稱為“超級(jí)細(xì)菌”，以其發(fā)現(xiàn)地新德里命名[3]。

Kumarasamy等[4]報(bào)道了NDM-1腸桿菌在印度、巴基斯坦以及英國(guó)等國(guó)家開(kāi)始流行，引起國(guó)際性的關(guān)注。隨后，美國(guó)、德國(guó)、日本、中國(guó)香港等地不斷檢出攜帶NDM-1的菌株，多為大腸埃希菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等臨床常見(jiàn)的致病菌[5]。2012年中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員在北京周邊養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)樣品中檢測(cè)到一株攜帶NDM-1的魯氏不動(dòng)桿菌，這也是中國(guó)首次在動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)現(xiàn)。隨后攜帶NDM-4、NDM-5、NDM-9等的菌株陸續(xù)在中國(guó)被檢出[6-7]。由此表明NDM基因在動(dòng)物中傳播具有潛在危險(xiǎn)，動(dòng)物性食品安全向人們敲響警鐘[8]。

目前檢測(cè)NDM-1的方法主要有紙片擴(kuò)散法[9]、Etest檢測(cè)法[10]、儀器方法[11]、PCR檢測(cè)法[12-13]、TaqMan熒光定量PCR[14-16]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[17]、基因芯片技術(shù)[18]等。其中，紙片擴(kuò)散法、Etest檢測(cè)法、微量稀釋法靈敏度低，缺乏特異性，僅適合初篩試驗(yàn)，而PCR可通過(guò)特異性引物對(duì)NDM-1陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行確證，但對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，且操作復(fù)雜，易發(fā)生污染。迄今未見(jiàn)有酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測(cè)NDM-1的報(bào)道。本研究利用表達(dá)純化的NDM-1可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，通過(guò)對(duì)該方法的工作條件進(jìn)行優(yōu)化，建立一種用于檢測(cè)細(xì)菌中NDM-1耐藥蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，以期為NDM-1蛋白ELISA檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原核表達(dá)載體 pET-28a、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、銅綠假單胞菌ATCC 9027由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。攜帶NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9基因的雞源大腸桿菌，由國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)中心提供。8周齡BALB/c健康雌性小鼠、SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由北京維德維康生物技術(shù)有限公司提供。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、鎳離子螯合層析柱、卡那霉素、Tris-HCl緩沖液、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)、50%聚乙二醇(PEG)、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、TMB顯色液購(gòu)自Sigma公司，LB培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 NDM-1重組蛋白的表達(dá)與純化

從GenBank中獲取NDM-1基因的氨基酸序列(Accession:AFI72857.1)，依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行NDM-1基因的堿基序列的密碼子優(yōu)化，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成了優(yōu)化后的基因序列。采用PCR方法擴(kuò)增NDM-1(G29-R270)，引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(表1)，為便于蛋白的純化，同時(shí)設(shè)計(jì)了His Tag標(biāo)簽和TEV酶切位點(diǎn)。將NDM-1(G29-R270)片段克隆至質(zhì)粒載體pET-28a中，然后通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，通過(guò)含有50 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板篩選陽(yáng)性單克隆，并進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

表1 擴(kuò)增NDM-1基因的引物序列

將重組NDM-1(G29-R270)陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，挑選陽(yáng)性克隆菌株，接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別在15 ℃條件下誘導(dǎo)16 h 和37 ℃條件下誘導(dǎo)4 h[7]。4 ℃條件下，3 200g離心15 min收集菌體，使用20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重懸菌體，3 000 W，10 s/10 s，15 min超聲裂解菌體。采用Ni-NTA鎳柱親和層析分離，收集目的蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)表達(dá)及純化結(jié)果，獲得NDM-1(G29-R270)蛋白。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 小鼠免疫與細(xì)胞融合

按照表2所示免疫程序，使用已獲得的NDM-1(G29-R270)蛋白免疫4只8周齡雌性BALB/c小鼠，四免1周后，對(duì)小鼠眼眶采血，室溫放置2 h，4 000 r/min離心10 min后采用間接ELISA方法對(duì)取血清檢測(cè)[19]。末次免疫后，將免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，用50%PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后用HAT培養(yǎng)基半換液，9 d后進(jìn)行全換液。

表2 單克隆抗體(小鼠)的免疫程序

1.3.2 雜交瘤細(xì)胞株篩選

待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，吸出雜交瘤細(xì)胞上清液，使用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞。并用NDM-1陽(yáng)性大腸桿菌和肺炎克雷伯菌裂解液包被的酶標(biāo)板再次篩選，陰性對(duì)照為SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清。前后共進(jìn)行3次亞克隆，以得到能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株[20]。

1.3.3 腹水制備及純化

選取健康的BALB/c經(jīng)產(chǎn)小鼠4只，腹腔內(nèi)注射無(wú)菌石蠟油(0.5 mL/只)。10～14 d后即可接種雜交瘤細(xì)胞，預(yù)處理過(guò)的小鼠2月內(nèi)均可使用。收集生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清。重懸于DMEM培養(yǎng)液中將細(xì)胞數(shù)調(diào)至0.5×106個(gè)/mL～1×106個(gè)/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL細(xì)胞懸液。次日觀察有無(wú)小鼠死亡情況，7 d后觀察小鼠腹部可否采集腹水，待小鼠腹部明顯膨大，消毒腹部皮膚后，用5 mL注射器接8號(hào)針頭刺入腹腔，收集腹水，每隔1 d抽取1次，一般可抽取3～5次。5 000 r/min離心10 min，收集淡黃色上清，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，約一周后收集腹水進(jìn)行分離純化。

純化：取5 mL離心后的腹水用50%硫酸銨沉淀，10 000 r/min離心30 min，取上清，用45%硫酸銨再次沉淀，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，沉淀溶于等體積PBS(0.01 mol/L pH 值7.4)中，4 ℃冰箱中透析2 d，每天換2次透析液；4 000 r/min離心10 min，收集上清。測(cè)量抗體濃度后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品制備

挑取待檢測(cè)的單克隆菌落于4 mL BHI肉湯培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃搖床中，100 r/min培養(yǎng)約2～4 h，4 ℃條件下，4 000 r/min離心5 min收集菌體，然后使用1 mL 20 mmol/L Tris-HCl(含150 mmol/L NaCl)重懸菌體，通過(guò)超聲裂解菌體(3 000 W，10 s/10 s，15 min)，作為待測(cè)樣品備用。

1.5 雙抗體夾心ELISA方法的建立

選擇合適的包被條件稀釋純化后的捕獲抗體至合適濃度，每孔加入100 μL進(jìn)行包被；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST(0.01 mol/L PBS，0.1%Tween-20，pH=7.4)洗板3次，每次3 min；每孔加封閉液100 μL，37 ℃溫育2 h，封閉結(jié)束后，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次，甩干；在酶標(biāo)板孔內(nèi)加入待測(cè)樣品，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3次，甩干；加入最適濃度HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，甩干；加入臨時(shí)配制的TMB溶液，每孔100 μL；37 ℃孵育10 min，加入終止液(2 mol/L H2SO4)50 μL/孔；用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450，計(jì)算樣品孔與陰性孔的比值(P/N)，以P/N大于2.1作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 捕獲抗體和檢測(cè)抗體的確定

將獲得的單克隆抗體分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，其余步驟按照雙抗體夾心ELISA步驟進(jìn)行操作，測(cè)定其P/N的值，根據(jù)P/N的值確定捕獲抗體和檢測(cè)抗體。

1.7 包被抗體和酶標(biāo)檢測(cè)抗體濃度的篩選

采用棋盤(pán)滴定法測(cè)定，將包被抗體分別按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000稀釋包被，HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體分別按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀釋，按雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，選擇P/N值最大時(shí)的濃度作包被抗體和檢測(cè)抗體的最佳使用濃度。

1.8 包被條件的篩選

分別用含0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)、0.015 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)、0.01 mol/L的Tris-HCl溶液(pH值8.0)和0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH值7.4，含0.15 mol/L NaCl)作為包被液，分別置于37 ℃孵育1 h、2 h及4 ℃孵育過(guò)夜，然后按照雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算P/N值，確定在該方法中所需最適的包被液以及包被時(shí)間。

1.9 靈敏度的判斷

將NDM-1陽(yáng)性及陰性的大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌活化后，接種于腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar，BHIA)培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落于BHI肉湯培養(yǎng)基中，置于搖床100 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h。將菌液按1%擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL，搖床100 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h。取少量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，剩余菌液3 000 r/min離心10 min，收集細(xì)菌沉淀。

將NDM-1陽(yáng)性的大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌分別用滅菌的PBS緩沖液以10倍梯度稀釋至108、107、106、105和104CFU/mL，利用優(yōu)化后的雙抗體夾心ELISA方法對(duì)每個(gè)稀釋梯度進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定該檢測(cè)方法的最低菌落數(shù)的檢出量，以判定該方法的敏感性。

1.9.1 特異性驗(yàn)證

采用建立的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。分別將攜帶NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9的陽(yáng)性對(duì)照菌和大腸桿菌ATCC 25922，大腸桿菌ATCC35150，鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，銅綠假單胞菌ATCC 9027等配制成108CFU/mL同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3個(gè)孔，以檢測(cè)其特異性。

1.9.2 重復(fù)性評(píng)價(jià)

板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：在同一塊板內(nèi)同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性、陰性等共5份耐藥菌菌數(shù)含量不同的樣品，每份樣品，重復(fù)5孔，按照雙抗體夾心ELISA進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份樣品的OD450值的變異系數(shù)(CV)以檢驗(yàn)板內(nèi)檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

板間重復(fù)性試驗(yàn)：取5塊用NDM-1抗體包被好的酶標(biāo)板在相同條件下，檢測(cè)5份不同耐藥菌菌數(shù)含量不同的樣品，按照雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份樣品在不同板間的OD450值的CV，以檢驗(yàn)板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDM-1蛋白的純化和鑒定

NDM-1表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-NDM-1經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行鎳柱親和層析純化，結(jié)果顯示：在相對(duì)分子質(zhì)量約54.6 kDa的區(qū)域出現(xiàn)明顯表達(dá)的蛋白條帶，該條帶與預(yù)期融合蛋白分子量大小一致，并且純度較高，而含有pET28a(+)-NDM-1的未誘導(dǎo)對(duì)照組和在15 ℃條件下誘導(dǎo)16 h的對(duì)照組，在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶(圖1)，說(shuō)明pET28a(+)-NDM-1表達(dá)成功，在非變性條件下，利用鎳柱親和層析柱對(duì)細(xì)胞裂解液上清中NDM-1蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果表明，獲得純化NDM-1蛋白(圖1)。

M1.蛋白Marker；M2.Western blot Marker；PC1.BSA (1 μg)；PC2.BSA (2 μg)；NC.未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液；1. 15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解液；2. 37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解液；NC1.未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解上清；NC2.未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解沉淀；3. 15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解液上清；4. 15 ℃誘導(dǎo)16 h的細(xì)胞裂解液沉淀；5. 37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解液上清；6. 37 ℃誘導(dǎo)4 h的細(xì)胞裂解液沉淀圖1 SDS-PAGE(A)和Western blot(B, GST標(biāo)簽抗體)檢測(cè)結(jié)果

2.2 抗血清效價(jià)的篩選

表3顯示，1號(hào)小鼠和2號(hào)小鼠血清效價(jià)均為1∶1 600時(shí)，3號(hào)小鼠血清效價(jià)為1∶12 800，4號(hào)小鼠血清效價(jià)為1∶25 600，對(duì)于后續(xù)生產(chǎn)陽(yáng)性對(duì)照血清來(lái)說(shuō)，滿足1∶3 200即可，因此選擇3號(hào)小鼠用于后續(xù)細(xì)胞融合。

表3 免疫BALB/c小鼠抗體效價(jià)ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.3 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株篩選

使用間接ELISA方法篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次亞克隆后，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到100%時(shí)可以建株。最終篩選到2株能穩(wěn)定分泌NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3H5和4G1，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雜交瘤培養(yǎng)上清檢測(cè)結(jié)果

2.4 抗體配對(duì)的篩選

采用3H5和4G1 2株單抗分別作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體，當(dāng)抗體不同稀釋度OD450值和陰性對(duì)照OD450值的比值(P/N)越大，靈敏度越高，效果越好。結(jié)果表明，當(dāng)3H5作為捕獲抗體，4G1作為檢測(cè)抗體，抗體稀釋濃度分別為1∶2 000和1∶8 000時(shí)，P/N的比值最高，為31.850(表5)。當(dāng)4G1作為捕獲抗體，3H5作為檢測(cè)抗體時(shí)，抗體稀釋濃度分別為1∶4 000和1∶32 000，此時(shí)P/N的比值最高，為10.650(表6)。因此，選擇3H5作為捕獲抗體，4G1作為檢測(cè)抗體時(shí)效果最優(yōu)。

表5 3H5為捕獲抗體的測(cè)定結(jié)果

表6 4G1為捕獲抗體的測(cè)定結(jié)果

2.5 包被抗體和檢測(cè)抗體工作濃度的確定

如表7所示，經(jīng)方陣法檢測(cè)，隨著包被抗體3H5濃度的降低和檢測(cè)抗體4G1稀釋倍數(shù)的增大，其OD450值不斷變小。當(dāng)3H5包被濃度為1∶2 000、4G1的稀釋濃度為1∶5 000時(shí)，P/N值達(dá)到最大，所以選擇1∶2 000和1∶5 000作為包被抗體3H5和檢測(cè)抗體4G1的最佳稀釋濃度。

表7 包被抗體(3H5)與檢測(cè)抗體(4G1)最佳工作濃度的確定

2.6 包被條件的確定

通過(guò)建立雙抗體夾心ELISA方法對(duì)包被條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)P/N的值確定最佳包被時(shí)間和稀釋液。結(jié)果如表8所示，0.05 mol/L，pH值9.6碳酸鹽緩沖液作為抗原包被液，4 ℃孵育過(guò)夜時(shí)，包被條件最好，且P/N值最大，因此選擇0.05 mol/L，pH值9.6碳酸鹽緩沖液，4 ℃孵育過(guò)夜作為最佳包被條件。

表8 包被條件的確定

2.7 雙抗體夾心ELISA方法的靈敏度

將帶有NDM-1的陽(yáng)性樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，用建立的雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)9。隨著樣品中NDM-1含量的升高，OD450值逐漸升高。以測(cè)定孔與陰性對(duì)照孔OD450值之比大于2.1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌中耐藥菌菌液濃度降低到105CFU/mL以下，P/N值就小于2.1；當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌中菌液濃度降低到106CFU/mL以下，P/N值就小于2.1。因此得出該方法對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌檢出測(cè)限為105CFU/mL，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌檢測(cè)限為106CFU/mL。

表9 雙抗體夾心ELISA檢測(cè)的靈敏度

2.8 特異性驗(yàn)證

分別選大腸桿菌ATCC 25922，大腸桿菌ATCC 35150，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031，鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606，銅綠假單胞菌ATCC 9027、陰性對(duì)照菌以及NDM-1、NDM-4、NDM-5、NDM-9陽(yáng)性對(duì)照菌，按照雙抗體夾心ELISA方法做交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表10。該方法中NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9等4種陽(yáng)性對(duì)照菌有明顯的交叉，這是因?yàn)閹追N亞型與NDM-1氨基酸差異小，所以會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)，但與大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606和銅綠假單胞菌ATCC 9027沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明本研究所建立的方法具有良好的特異性。

表10 特異性檢測(cè)

2.9 重復(fù)性評(píng)價(jià)

2.9.1 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

在同一塊板內(nèi)同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性、陰性等共5份耐藥菌，樣品的含菌數(shù)量不同，每份樣品，重復(fù)5孔，按照試劑盒的操作程序，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份樣品OD450值的變異系數(shù)，以檢驗(yàn)板內(nèi)檢測(cè)樣品的重復(fù)性。由表11可以看出其中OD450值變異系數(shù)均小于6%。具有良好的板內(nèi)重復(fù)性。

表11 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

2.9.2 板間重復(fù)性試驗(yàn)

取5塊用NDM-1抗體包被好的酶標(biāo)板，在相同條件下檢測(cè)5份不同耐藥菌，樣品含菌數(shù)量不同，按照試劑盒的操作程序，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份樣品在不同板間的OD450值的變異系數(shù)，以檢驗(yàn)板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。由表12可以看出板內(nèi)檢測(cè)的5份樣品的OD450值變異系數(shù)均小于10%。說(shuō)明板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性好。

表12 板間重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外NDM-1細(xì)菌的報(bào)道越來(lái)越多，甚至已在全球范圍流行并引發(fā)多種類(lèi)型的感染，不僅可直接威脅人類(lèi)健康，還可通過(guò)動(dòng)物性食品對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重的威脅[21-22]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者針對(duì)NDM-1基因研究建立了普通PCR、熒光定量PCR等快速檢測(cè)方法，對(duì)于雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)NDM-1研究報(bào)道甚少。本研究采用化學(xué)合成的方法獲得優(yōu)化后的NDM-1蛋白基因序列，并將其克隆至表達(dá)載體pET-28a，得到重組質(zhì)粒pET-28a-NDM-1(G29-R270)，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)并純化。通過(guò)免疫BALB/c小鼠，獲得了2株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3H5和4G1，分別用作捕獲抗體和檢測(cè)抗體，建立雙抗體夾心ELISA方法。

雙抗體夾心ELISA方法是一個(gè)多成分系統(tǒng)，每個(gè)成分都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響，針對(duì)捕獲抗體和檢測(cè)抗體，濃度過(guò)高易造成蛋白分子多層化，容易將蛋白洗掉造成浪費(fèi)，而且容易造成試驗(yàn)的非特異性；濃度過(guò)低易造成假陰性。包被條件對(duì)結(jié)果影響很大，若溫度過(guò)低則需要延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，溫度高則應(yīng)減少反應(yīng)時(shí)間[23]，因此本研究選擇4 ℃包被過(guò)夜，捕獲抗體和檢測(cè)抗體的稀釋度分別選擇1∶2 000和1∶5 000。

研究發(fā)現(xiàn)，攜帶NDM-1基因的細(xì)菌主要有大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等[24-25]。因此，本試驗(yàn)檢測(cè)了上述幾種耐藥菌中NDM-1耐藥蛋白的靈敏度和特異性，結(jié)果顯示，NDM-1陽(yáng)性大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的最低濃度為1×105CFU/mL，NDM-1陽(yáng)性鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的最低濃度為1×106CFU/mL。應(yīng)用該方法檢測(cè)NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9，與4種陽(yáng)性對(duì)照有明顯的交叉，但與大腸桿菌ATCC 25922、大腸桿菌ATCC 35150、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606、肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031和銅綠假單胞菌ATCC 9027均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明此方法具有良好的特異性；對(duì)本方法進(jìn)行了重復(fù)性試驗(yàn)，得到板內(nèi)變異系數(shù)小于6%，板間變異系數(shù)小于10%，說(shuō)明本方法具有良好的重復(fù)性。