烏三金洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李德林 張子俠

安徽省太和縣中醫(yī)院，安徽 太和 236600

帶下病是目前臨床發(fā)病率較高且難以治愈的婦科疾病之一，西醫(yī)中的陰道炎、宮頸炎、盆腔炎性等疾病均屬于此范疇，該病具有慢性纏綿且易復(fù)發(fā)的特點，給廣大女性身心健康帶來了很大的困擾[1]。因此，尋找有效、持久、低毒的治療女性帶下病藥物十分必要?，F(xiàn)代基礎(chǔ)及臨床研究[2]表明，中醫(yī)藥在治療女性帶下病上不僅療效顯著，且作用持久不易復(fù)發(fā)，適合長期使用。烏三金洗劑由烏梅、土荊皮、黃柏、大黃及苦參等十味中藥組成，功能除濕祛毒、殺蟲止癢。處方遵照中醫(yī)理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，提出“蟲邪外感、濕熱蘊結(jié)”，是從“濕”“毒”“蟲”著手來研究揭示“帶下病”的一般病機規(guī)律，采取辨病與辯證的方法，針對濕毒蘊膚型皮膚黏膜疾病所擬定的方劑。本制劑在我院已應(yīng)用多年，臨床效果較好，然而尚缺乏有效的質(zhì)量控制方法，為了更好的保證制劑質(zhì)量及臨床用藥的安全性和有效性，本研究采用TLC法對烏三金洗劑中黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮進行定性鑒別研究，并采用HPLC法對烏三金洗劑中蛇床子素含量進行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XSE105DU型十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多)；Ultimate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛)；PHS-2F型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)；DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(上海杰理科技有限公司)。

1.2 試藥 大黃對照藥材(批號：120984-201202)、鹽酸小檗堿(批號：110713-201613)、蛇床子素(批號：110822-201609)、苦參堿(批號：110805-200508)、土荊皮乙酸對照品(批號：110880-201604)等均購自中國食品藥品檢定研究院。烏三金洗劑(規(guī)格：每瓶250 mL，本院中藥制劑室自制，批號：20170824，20170825，20170826)。蛇床子、黃柏、烏梅、大黃等十味中藥均購自于安徽守正中藥飲片有限公司，并經(jīng)本院馬德強主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部及2019年版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》要求；乙腈為色譜純，水為純化水，甲醇、乙醚、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 黃柏 取烏三金洗劑10 mL，加甲醇10 mL超聲處理20 min，離心，取上清液作為供試品溶液[3-4]；另取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含黃柏的樣品，同法制得缺黃柏陰性對照溶液。照TLC法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水(6∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，陰性無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出黃柏。結(jié)果如圖1所示。

1.鹽酸小檗堿對照品溶液;2～4.供試品溶液；5.陰性樣品圖1 黃柏TLC鑒別圖

2.1.2 苦參 取烏三金洗劑10 mL，滴加濃氨水將溶液pH調(diào)至10～11，氯仿振搖提取3次，每次 15 mL，合并提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，即得供試品溶液[5-6]；另取苦參堿對照品適量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液；再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含苦參的樣品，同法制得缺苦參陰性樣品溶液。照TLC法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-濃氨試液(2∶3∶4∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液并吹干。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與苦參堿對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橘紅色斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出苦參。結(jié)果如圖2所示。

1.苦參堿對照品溶液；2～4.供試品溶液；5.陰性樣品圖2 苦參TLC鑒別圖

2.1.3 大黃 取烏三金洗劑10 mL，加鹽酸 1 mL，加熱回流30 min，立即冷水冷卻至室溫，以無水乙醚提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘渣加氯仿1 mL使溶解，即得供試品溶液[7-8]；另取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，余下同供試品溶液制備方法，作為對照藥材溶液；再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含大黃的樣品，同法制得缺大黃陰性對照溶液。照TLC法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以甲酸乙酯-石油醚(30～60 ℃)-甲酸(5∶15∶1)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與大黃對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，置氨蒸氣熏后，斑點變?yōu)榧t色，清晰可見，且陰性樣品無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出大黃。結(jié)果如圖3所示。

1.大黃對照藥材溶液;2～4.供試品溶液;5.陰性樣品

1.大黃對照藥材溶液;2～4.供試品溶液;5.陰性樣品圖3 大黃TLC鑒別圖

2.1.4 蛇床子 取烏三金洗劑20 mL，用無水乙醚振搖萃取2次，每次30 mL，乙醚層合并，加入10 mL碳酸氫鈉飽和溶液振搖提取，乙醚層蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，即得供試品溶液[9-10]；另取蛇床子素對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液；再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含蛇床子的樣品，同法制得缺蛇床子陰性對照溶液。照TLC法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品及陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，以正己烷-乙酸乙酯(17∶4)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出蛇床子。結(jié)果如圖4所示。

1.蛇床子素對照品溶液；2～4.供試品溶液；5.陰性樣品圖4 蛇床子TLC鑒別圖

2.1.5 土荊皮 取烏三金洗劑30 mL，濃縮至稠，加硅膠(100-200目)5 g拌勻，干燥至干，研勻，加乙醚30 mL超聲30 min，濾過，取濾液，用5%碳酸氫鈉溶液30 mL提取，取碳酸氫鈉溶液，滴加稀鹽酸調(diào)pH為1～2，以乙醚30 mL提取，乙醚提取液用水10 mL洗滌，取乙醚層，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液[11]；另取土荊皮乙酸對照品適量，加甲醇制成每1毫升含1 mg的對照品溶液。再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含土荊皮的樣品，同法制得缺土荊皮陰性對照溶液。照TLC法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述供試品及陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，以石油醚(30-60 ℃)-三氯甲烷-冰醋酸(6∶10∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以4%香草醛乙醇溶液-20%硫酸溶液(1∶1，臨用前混合)的混合溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與土荊皮乙酸對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出土荊皮。結(jié)果如圖5所示。

1.土荊皮乙酸對照品溶液；2～4.供試品溶液; 5.陰性樣品圖5 土荊皮TLC鑒別圖

2.2 蛇床子素HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津Wonda Cract ODS2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(70∶30)；流速：1.0 mL/min；柱溫設(shè)置為30 ℃；檢測波長為322 nm；理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計應(yīng)不得低于3000，進樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1毫升含12.63 μg的蛇床子素對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取本品 25 mL，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液置水浴上蒸干，殘渣加乙醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得[12-13]。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按烏三金洗劑處方和制備工藝制備缺蛇床子的陰性樣品，再按“2.2.2.2”項下方法制備缺蛇床子陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗 按“2.2.1”項下色譜條件，分別吸取上述供試品溶液、蛇床子素對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，記錄各自色譜圖。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相同的保留時間內(nèi)出現(xiàn)蛇床子素色譜峰，且蛇床子素分離度及拖尾因子均符合要求，而陰性對照無干擾，故該法專屬性良好。結(jié)果如圖6所示。

A.蛇床子素對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.蛇床子素色譜峰圖6 蛇床子素HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2.1”項下的蛇床子素對照品溶液適量，置自動進樣器中，分別吸取1、2、5、10、15、20 μL于液相色譜儀中，再按上述“2.2.1”項下色譜條件進樣，并記錄峰面積。并以蛇床子素對照品進樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。結(jié)果得蛇床子素的回歸方程為：Y= 0.0606X- 0.0062(r=0.9999)，以上結(jié)果表明蛇床子素在進樣量為12.63 ～ 252.60 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.2.1”項下蛇床子素對照品溶液適量，置自動進樣器中，按“2.2.1”下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定蛇床子素峰面積。結(jié)果蛇床子素平均峰面積為6.539，RSD為0.26%(n=6)，說明該儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取烏三金洗劑(批號：20170824)25 mL，按“2.2.2.2”下制備方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件，將供試品溶液置于自動進樣器中，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，并記錄蛇床子素峰面積，結(jié)果蛇床子素平均峰面積為7.814。RSD為0.11%(n=6)，表明烏三金洗劑供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密量取同一批次的烏三金洗劑6份(批號：20170824)，每份25 mL，按上述“2.2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，置于自動進樣器中，再按上述“2.2.1”項下色譜條件進樣，測定蛇床子素峰面積。結(jié)果蛇床子素平均峰面積為7.762，RSD為0.56%(n=6)。表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的烏三金洗劑6份(批號：20170824)，每份12.5 mL，分別精密加入蛇床子素對照品適量，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，置于自動進樣器中，再按上述“2.2.2.1”項下色譜條件，測定蛇床子素峰面積并計算其蛇床子素加樣回收率。結(jié)果6份樣品的平均回收率為96.45%，RSD為0.93%(n=6)。表明樣品回收率良好，該法準(zhǔn)確度較高。

2.2.9 樣品含量測定及含量限度的確定 通過投料前對蛇床子藥材中蛇床子素含量測定，以及生產(chǎn)的成品中蛇床子素的含量比較，計算得到該工藝蛇床子素的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，蛇床子飲片中蛇床子素含量為2.94 %，根據(jù)處方換算，烏三金洗劑中蛇床子素的理論含量為1.0584 mg/mL，即制成制劑后每毫升含蛇床子素為1.0584 mg。實際生產(chǎn)中，批號為20170824、20170825、20170826三批樣品中蛇床子素的含量分別為12.84 μg/mL、12.67 μg/mL、12.65 μg/mL，轉(zhuǎn)移率分別為1.21%、1.20%、1.19%，平均轉(zhuǎn)移率為1.20%。根據(jù)中國藥典2015年版一部規(guī)定：蛇床子飲片中蛇床子素的含量不得少于1.0%，因此，制成制劑后含量限度確定為：每毫升含蛇床子以蛇床子素(C15H16O3)計，不得少于4.32 μg，三批樣品所測得含量，每毫升含蛇床子素均高于4.32 μg。結(jié)果見表1。

表1 含量限度考察結(jié)果

3 討論

3.1 薄層鑒別 黃柏薄層鑒別時，參考相關(guān)文獻[14-15]，同苦參處理方法，將樣品堿化后用氯仿提取，結(jié)果顯示樣品主斑點雖較為清晰，但陰性樣品在與對照品溶液色譜處有微弱干擾，考慮到此法在提取親脂性生物堿的同時，也帶來親脂性雜質(zhì)，遂改用醇類溶劑提取法，采用甲醇直接超聲，結(jié)果斑點清晰，陰性無干擾，且該法更為簡單?？鄥⒈予b別時，以丙酮-甲苯-甲醇(3 ∶8∶0.5)為展開劑，再以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水(4∶2∶2∶1)上層溶液為展開劑，結(jié)果斑點雖較為清晰，陰性無干擾，但操作較為復(fù)雜，且甲苯對環(huán)境及人體的健康危害較大，故改用乙酸乙酯-環(huán)己烷-丙酮-濃氨試液(4∶2∶3∶0.2)為展開劑，效果較為理想。此外，本研究還對方中烏梅、百部、地膚子及花椒等藥味進行了薄層鑒別研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)百部及地膚子陰性對照有干擾，花椒及烏梅因主要含有揮發(fā)性成分，本制劑在傳統(tǒng)水提工藝下，尚不能對兩者揮發(fā)性成分充分提取，故與對照藥材相比，主斑點較不清晰，暫未納入烏三金洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 提取方法的優(yōu)化 因蛇床子在方中作為君藥，蛇床子素作為蛇床子藥材中含量最高且主要藥理活性成分，有研究[16]報道其具有較好的止癢、抗菌及增強免疫功能等作用，可治療陰道炎及外陰濕疹等婦科疾病，與烏三金洗劑的主要功效尤為相似，故本研究擬將其作為烏三金洗劑HPLC測定的指標(biāo)性成分。蛇床子素屬于香豆素類化合物，文獻報道[17-18]，蛇床子及其制劑中蛇床子素中的提取方法有乙酸乙酯萃取、乙醚萃取及甲醇超聲提取等。研究前期曾對以上方法進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯萃取提取率較高，并對萃取次數(shù)進行了考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取4次蛇床子素含量較萃取3次高，而與萃取5次相差不大，說明萃取4次可提取完全，故本研究以乙酸乙酯萃取4次作為蛇床子素的最佳提取方法。

3.3 流動相和色譜柱的考察 烏三金洗劑為中藥復(fù)方制劑，方中干擾成分較多，流動相的優(yōu)化和色譜柱的選擇對樣品的分離有著重要的影響。研究曾參考相關(guān)文獻對甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液及乙腈-水進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機相為乙腈時，理論塔板數(shù)較甲醇高，且出峰時間較短，無機相為水或磷酸水溶液對峰形影響不大。此外，研究又對不同品牌的色譜柱(Thermo Syncronis C18、Hypersil ODS2及Wonda Cract ODS2)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Thermo Syncronis C18柱上蛇床子素分離度較差，Wonda Cract ODS2較Hypersil ODS2出峰時間短且分離效果較好。故本研究選擇以乙腈-水溶液和Wonda Cract ODS2柱作為最佳流動相和色譜柱。

綜上所述，研究建立的黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮的TLC陰性對照無干擾、斑點清晰且專屬性較強。蛇床子素的HPLC含量測定方法簡便易行，重現(xiàn)性較好，為控制和評價烏三金洗劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。然而由于受條件限制，本實驗僅涉及單一成分的含量測定，還不能從整體上完全反映烏三金洗劑的內(nèi)在質(zhì)量，故下一步本研究擬采用指紋圖譜技術(shù)對該制劑進行深層次的探究，以建立起更完整的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。