血水草TLC鑒別方法的建立

曾 琦 徐作剛

1.黔南州檢驗(yàn)檢測院，貴州 都勻 558000；2.黔南州檢驗(yàn)檢測院，貴州 都勻 558000

血水草(EomeconchionanthaHance)是中國亞熱帶第三紀(jì)孑遺物種，是我國獨(dú)有的單種屬植物。血水草主要分布于貴州南部和北部，福建北部和西部，江西、廣東、廣西、安徽、四川的東部和東南部，浙江西南部，湖南、湖北西南部，云南東部等[1]?！吨袊参镏尽穂2]《貴州草藥》[3]《黔本草》[4]《中華本草》(苗藥卷)[5]等均有收載。血水草 “味苦、性寒、有小毒，具清熱解毒、止血、活血止痛之功效，主治目赤腫痛、咽喉疼痛、口腔潰瘍、尿路感染、療瘡腫毒、毒蛇咬傷、癬疹、濕疹、跌打損傷、腰痛、咳血”，全草入藥[6-7]。至今為止，文獻(xiàn)[8-10]報(bào)道己從血水草中分離得到6個生物堿和1個三萜類，生物堿類化合物是血水草的主要有效成分,包括白屈菜紅堿、血根堿、原阿托品堿、別隱品堿、氧化血根堿、白屈菜紅默堿等。根據(jù)血水草其化學(xué)成分，為有效控制血水草藥材質(zhì)量，選擇白屈菜紅堿和血根堿為對照對血水草進(jìn)行TLC鑒別[11]。該方法簡便易操作，專屬性強(qiáng)，結(jié)果重復(fù)性較好。

1 儀器與試藥

SK250LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)儀器有限公司)，瑞士梅特勒AG135電子天平，血根堿對照品(2～10 ℃冷藏)(批號：510001-201101,含量99.3%，中檢院)，白屈菜紅堿(111718-201402,含量80.5%，中檢院)，樣品S1于2020年3月采摘于都勻市擺忙鄉(xiāng)，S2 于2020年6月采摘于重慶市奉節(jié)縣，S3于2020年9月采摘于貴定縣巖下村，硅膠G(批號：20160926),硅膠G (批號：00081110)，均為青島海洋化工有限公司制造；其余試劑均為分析純。樣品采集信息見表1，均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定。樣品洗凈后曬干，粉碎，過2號篩，放入干燥器中常溫保存。如圖1所示。

A.2020年4月采摘于都勻市擺忙鄉(xiāng)；B.2020年4月采摘于福建南平市；C.2020年9月拍攝于貴定縣巖下村；D.2020年8月拍攝于廣西桂林全州方縣大西鎮(zhèn)炎井村圖1 血水草干品及深景圖

表1 血水草樣品采集信息

2 試驗(yàn)方法與試驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品中所需成分提取方法的考察 分別取樣品S1～S3各1.0 g，按下述方法提?。孩偌蛹状?20 mL，53 HZ超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；②加75%乙醇20 mL，53 HZ超聲 30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；③加二甲基亞砜20 mL，53 HZ超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

另取血根堿對照品及白屈菜紅堿對照品適量，加乙醇分別制成0.5 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。取上述供試品溶液及對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)的混懸溶液為展開劑，飽和30 min后，展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。

試驗(yàn)結(jié)果：方法①主斑點(diǎn)清晰；方法②主斑點(diǎn)清晰，且提取溶劑毒性較??；方法③主斑點(diǎn)未能顯示，未能辨別。方法②操作簡便，溶劑毒性較小，薄層色譜圖譜展距適中，斑點(diǎn)清晰，干擾少，故選擇方法②為供試品溶液的制備方法。

2.2 不同展開系統(tǒng)的考察 取S1～3樣品按提取方法②制成供試品溶液，取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，分別在下述展開系統(tǒng)中展開：①氯仿-甲醇(12∶4)；②氯仿-甲醇-乙酸乙酯(14∶1∶1)；③氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(9∶1∶0.2∶0.05)；④甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)。分別均飽和30 min后，在各展開系統(tǒng)中展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。試驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示。

1.血根堿對照；2.白屈菜紅堿對照；3.樣品S1；4.樣品S2；5.樣品S3; A. 氯仿-甲醇(12∶4)展開劑；B.氯仿-甲醇-乙酸乙酯(14∶1∶1)；C.氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(9∶1∶0.2∶0.05)；D.甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)圖2 血水草TLC圖

試驗(yàn)結(jié)果：系統(tǒng)①②樣品與對照品完全未分離，系統(tǒng)分離效果非常差，斑點(diǎn)不清晰，拖尾較嚴(yán)重；系統(tǒng)③兩個主斑點(diǎn)清晰，分離效果好，但展開劑中氯仿毒性較大；系統(tǒng)④兩個主斑點(diǎn)清晰，分離效果好，展開劑的毒性較小，因此選擇④為血水草薄層色譜鑒別的展開系統(tǒng)。

2.3 耐用性考察 按照國家藥典委員會《中藥分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則實(shí)施細(xì)則》的相關(guān)要求，分別進(jìn)行耐用性考察。

樣品點(diǎn)樣量的考察：取S5樣品按提取方法②制成供試品溶液，分別取供試品溶液1、2、3、5、6、8、10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯：甲醇：氨水(24∶1∶0.05)溶液為展開劑，飽和30 min后，展開，取出，晾干，在365 nm紫外燈下觀察，結(jié)果供試品溶液以點(diǎn)樣量2 μL效果最佳?？紤]因產(chǎn)地、季節(jié)影響，樣品含量有所差異，故點(diǎn)樣體積選擇為2 μL。

溫度的考察：進(jìn)行了低溫(10 ℃)、室溫(25 ℃)、高溫(35 ℃)的考察，分離效果均較好，斑點(diǎn)清晰，三個溫度下的展開效果均未有明顯差異。

濕度的考察：進(jìn)行了低濕度(30%)、中等濕度(50%)和高濕度(75%)的考察，結(jié)果表明在上述條件下都能較好分離，未有明顯差異；耐用性較好。

薄層板的考察：選用硅膠G預(yù)制板、自制硅膠G板，結(jié)果均能較好分離。

2.4 血水草的薄層色譜鑒別方法 取本品細(xì)粉1.0 g，加75%乙醇20 mL，超聲30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取血根堿，白屈菜紅堿對照品適量，加乙醇分別制成每1 mL含0.5 mg的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》 2015版通則0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲醇-氨水(24∶1∶0.05)的混懸溶液為展開劑，硅膠G薄層板置層析缸中飽和30 min，展開，取出，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。10批次樣品薄層色譜圖如圖3所示。

圖3 10批血水草藥品TLC圖

3 討論

生物堿是血水草中的主要成分及藥理活性物質(zhì)，當(dāng)中以白屈菜紅堿和血根堿的含量較高，且易溶于甲醇，乙醇，二甲基亞砜等有機(jī)溶劑。故選取安全、經(jīng)濟(jì)且最常用的75%乙醇作為提取溶劑，且血水草中其他組分對檢測干擾較小。文中所用到的③④展開劑，都能達(dá)到預(yù)期效果，但由于展開劑③中氯仿的毒性較大，故選用毒性較小的展開劑④；血水草全草中所顯主要斑點(diǎn)與血根堿對照、白屈菜紅堿對照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，位置居中，溫濕度或薄層板厚度對色譜效應(yīng)的影響較小結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好。參照薄層色譜法(2015年版《中國藥典》通則0502)，分別對展開劑，薄層板等條件進(jìn)行考察，并按照國家藥典委員會《中藥分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則實(shí)施細(xì)則》的相關(guān)要求進(jìn)行方法學(xué)耐用性考察。

本方法篩選出的薄層色譜鑒別方法分離度較好，專屬性強(qiáng)，可作為血水草中血根堿和白屈菜紅堿的薄層鑒別方法。