• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熱應激對大鼠脾臟組織形態(tài)學及TLR2/4表達的影響

    2022-01-27 02:12:00張志雷
    關鍵詞:脾臟機體基因

    陳 玲,董 川,張志雷

    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 體育教學部,甘肅 蘭州 730070;2.菏澤學院 體育與健康學院,山東 菏澤 274015)

    隨著全球氣候的逐漸變暖,高溫已成為影響人類和動物健康的重要環(huán)境應激源之一.在外界的高溫環(huán)境刺激下,動物的體表溫度超出了自身體溫調節(jié)能力的范疇,進而對機體組織器官造成不同程度的損傷(熱應激).研究表明,熱應激不僅會影響機體的生長發(fā)育[1-2]、生產(chǎn)性能和繁殖性能[3-5],也會導致其免疫機能紊亂[6],進而增加許多疾病風險,對人體健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟構成很大的威脅.Toll樣受體(TLRs)作為一類位于哺乳動物細胞表面的跨膜信號受體,在機體的先天性和獲得性免疫應答中均發(fā)揮著關鍵性的調控作用.這種免疫應答反應不僅表現(xiàn)在宿主應對外源性病原微生物感染方面,也體現(xiàn)在識別內源性細胞損傷后釋放的危險信號方面[7].TLRs與其配體特異性結合后,可通過合成并分泌一系列細胞因子以及促進黏附分子的表達,從而激活宿主的免疫防御系統(tǒng)[8].TLRs基因家族內含有很多成員,目前在哺乳動物中至少鑒定到13個成員[9],最具代表性且在免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用的成員是Toll樣受體2(TLR2)和Toll樣受體4(TLR4).TLR2在不同組織細胞中廣泛存在,但主要在巨噬細胞等免疫細胞中表達,在機體抵御外源微生物侵襲的先天性免疫中起重要調控作用[10-11].TLR4作為膜型Toll樣受體之一,也在機體的免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用[11].

    截至目前,關于熱應激對哺乳動物免疫相關組織器官中TLR2和TLR4基因表達影響的研究報道較少,且TLR2和TLR4在不同熱應激狀態(tài)下的生物學功能尚不明確.鑒于此,本研究通過建立不同高溫條件及不同持續(xù)時間的大鼠熱應激模型,比較觀察不同熱應激條件下脾臟的組織形態(tài)學差異,分析不同熱應激條件對脾臟中免疫相關基因TLR2和TLR4的表達及其編碼蛋白陽性信號分布位置的影響,旨在探究熱應激對大鼠脾臟組織結構以及TLR2和TLR4的表達調控作用,為更深入探究由TLR2/4介導的免疫相關通路在動物熱應激免疫防御中的分子調控機制提供科學依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料

    8周齡成年雄性Wistar大鼠,由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所動物實驗中心提供;焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA提取試劑、反轉錄試劑盒(StarScript II Green Fast Two-Step qRT-PCR Synthesis Kit)、熒光定量PCR試劑盒(2×RealStar Green Fast Mixture)等均購自北京GenStar康潤生物公司;蘇木精染液、伊紅染液、中性樹膠購自碧云天生物公司;一抗(Rabbit Anti-TLR2,Rabbit Anti-TLR4,Rabbit Anti-beta-Actin)、二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司;EDTA抗原修復緩沖液、自發(fā)熒光淬滅劑、牛血清白蛋白(BSA)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液、抗熒光淬滅封片劑染液購自武漢賽維爾公司.

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組及組織收集 選用健康狀況良好、體重相似(270~290 g)的8周齡成年雄性Wistar大鼠30只.適應性飼養(yǎng)1 d后,將其隨機分為5組(n=6),即對照組(CG)、38 ℃單次熱應激組(38 ℃-單激組,38 ℃-SHSG)、38 ℃多次熱應激組(38 ℃多激組,38 ℃-MHSG)、43 ℃單次熱應激組(43 ℃單激組,43 ℃-SHSG)、43 ℃多次熱應激組(43 ℃多激組,43 ℃-MHSG).對照組大鼠在溫度18~22 ℃、相對濕度30%左右條件下飼養(yǎng),38 ℃單激組和43 ℃單激組分別在38 ℃和43 ℃智能人工氣候培養(yǎng)箱中(提供充足飲水)持續(xù)熱處理6 h,而38 ℃多激組和43 ℃多激組分別于每天中午12:00~14:00在38 ℃和43 ℃智能人工氣候培養(yǎng)箱中進行熱處理2 h,連續(xù)處理3 d,共計6 h.所有熱處理組其余時間的飼養(yǎng)條件與對照組一致.熱處理結束后,立即頸部脫臼處死所有大鼠,迅速采集各處理組脾臟組織,一部分組織樣品放入DEPC水處理過的1.5 mL凍存管后迅速投于液氮中,之后轉入-80 ℃冰箱保存,用于提取總RNA;另一部分放入4%的多聚甲醛溶液中固定后,用于包埋組織蠟塊.

    1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 各脾臟組織分別經(jīng)液氮迅速研成粉末后,用總RNA提取試劑提取組織總RNA,并經(jīng)DEPC處理水溶解.用超微量分光光度計(Nanodrop ND-2000, 美國Thermo公司)檢測總RNA濃度和純度,選取A260/A280=1.8~2.0的RNA樣品經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,選擇完整性好的RNA將其濃度調整為200 ng·μL-1,按照反轉錄試劑盒操作說明,合成第一鏈cDNA,并將其保存于-20 ℃冰箱用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR).

    1.2.3 引物設計與合成 根據(jù)NCBI/GenBank數(shù)據(jù)庫中提供的大鼠TLR2、TLR4和β-actin基因的mRNA序列,使用軟件Oligo 6.0設計引物,并用BLAST對引物特異性進行檢測,引物由西安擎科澤西生物公司進行合成,相關信息列于表1.

    表1 引物序列信息

    1.2.4 qRT-PCR 按照熒光定量PCR試劑盒建議的方法,以優(yōu)化后的條件進行qRT-PCR擴增(以β-actin作為內參基因).反應體系為20 μL:上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL, 2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL, cDNA 0.4 μL, ddH2O 8.8 μL.采用優(yōu)化后的兩步法反應程序,即94 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)進行基因擴增.實驗結束后采集Ct值,采用2-ΔΔCt方法[12]進行目的基因表達量的計算.每個樣本設計4個重復.

    1.2.5 HE染色 不同處理組脾臟組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,遞減濃度梯度酒精脫水后,用蘇木精染液染色5 min,1%的鹽酸-酒精分化液分化5 s,0.5%的伊紅染液染色2 min.然后在系列遞增濃度梯度酒精中脫水,并于二甲苯中透明,中性樹膠封片后,于光學顯微鏡(寧波舜宇顯微鏡)下觀察并拍照.

    1.2.6 免疫熒光染色 石蠟切片經(jīng)二甲苯透明,遞減梯度酒精脫水后,置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(pH=9.0)中于微波爐內進行抗原修復.加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min,流水沖洗后,滴加BSA室溫封閉30 min.甩掉封閉液,滴加稀釋后的一抗TLR2(1∶3000)和TLR4(1∶3500)后,放于濕盒內4 ℃孵育過夜.滴加與一抗相應種屬的二抗,室溫孵育50 min(避光).滴加DAPI染液,室溫復染10 min(避光).抗熒光淬滅封片劑封片后,切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像.

    1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與結果分析 采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗,結果用平均值±標準差表示,P<0.05表示差異顯著.

    2 結果

    2.1 不同熱應激條件下大鼠脾臟組織形態(tài)學比較

    由HE染色結果(圖1)可知,在對照組的大鼠脾臟組織中,紅髓與白髓界限比較明顯,白髓較多,而在各處理組的大鼠脾臟組織中,紅髓與白髓界限不明顯,白髓所占比例減少,而紅髓比例增加.與38 ℃處理組相比,在43 ℃處理組中,白、紅髓界限更加模糊,脾竇嚴重萎縮,位于紅髓內的紅細胞數(shù)量明顯減少.與單激組相比,多激組中位于白髓和紅髓之間的邊緣區(qū)明顯變寬.

    △ 白髓;☆ 紅髓;→ 脾竇;◇ 邊緣區(qū)

    2.2 不同熱應激條件下大鼠脾臟中TLR2和TLR4基因表達水平

    由qRT-PCR結果(圖2)可知,不同處理組大鼠脾臟中TLR2和TLR4 mRNA的表達趨勢相似.與對照組相比,TLR2和TLR4 mRNA表達量在38 ℃熱應激條件下上調,而在43 ℃熱應激條件下調.在38 ℃熱應激條件下,多激組中TLR2和TLR4 mRNA表達量低于單激組,而在43 ℃熱應激條件下,多激組中TLR2和TLR4 mRNA表達量高于單激組.這可能是由于43 ℃(相比38 ℃)超出了大鼠機體本身可調節(jié)的高溫閾值,對大鼠脾臟組織的免疫功能造成嚴重的損傷所導致,并且溫度越高、持續(xù)時間越長,這種損傷作用就越明顯.

    2.3 不同熱應激條件下大鼠脾臟中TLR2和TLR4蛋白的陽性信號分布特征

    由TLR2和TLR4蛋白的免疫熒光染色結果(圖3)可知,不同處理組脾臟組織中TLR2和TLR4蛋白的免疫陽性信號表達強度與mRNA表達趨勢類似:在相同處理組中,TLR4蛋白陽性信號(綠色)強于TLR2蛋白(紅色);與對照組(圖3A2-A3)相比,38 ℃熱激組中TLR2和TLR4蛋白陽性信號明顯增強(圖3B2-B3,C2-C3),而43 ℃熱激組中TLR2和TLR4蛋白陽性信號明顯減弱(圖3D2-D3,E2-E3).在不同處理組大鼠脾臟組織中,TLR2和TLR4蛋白陽性信號均定位于紅髓巨噬細胞的細胞膜上(圖3A2-E2,A3-E3).此外,對于TLR2蛋白而言,其強烈定位于對照組和38 ℃熱激組脾索中(圖3A2-C2),并且與對照組相比,其在各熱激組中也定位于邊緣區(qū)巨噬細胞的細胞膜上(圖3B2-E2);對于TLR4蛋白而言,其在各處理組中也定位于邊緣區(qū)巨噬細胞的細胞膜上(圖3A3-E3),并且在對照組和38 ℃熱激組中也定位于白髓巨噬細胞的細胞膜上(圖3A3-C3).

    A TLR2 mRNA相對表達量;B TLR4 mRNA相對表達量.內參基因:β-actin,n=4,不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)

    A1~E1. DAPI核染(藍色);A2~E2. TLR2陽性細胞(紅色);A3~E3. TLR4陽性細胞(綠色);A4~E4. TLR2和TLR4陽性細胞的共定位;WpMΦ.白髓巨噬細胞;RpMΦ.紅髓巨噬細胞;MZMΦ.邊緣區(qū)巨噬細胞;SC.脾索

    3 討論

    熱應激可影響動物機體的免疫器官發(fā)育及免疫應答過程[13-15],其對機體免疫功能的影響主要表現(xiàn)在淋巴細胞數(shù)量發(fā)生變化、巨噬細胞活性降低、免疫細胞群改變等方面[16],但這種影響程度因熱應激條件的不同而存在很大差異.脾臟作為動物體最大的免疫器官,在免疫防御應答中扮演著十分重要的角色.Park等[14]通過比較轉錄組學研究發(fā)現(xiàn),在熱應激條件下,雞(Gallusgallus)脾臟中許多與免疫應答和炎癥反應相關的信號通路被激活.Ma等[17]運用基于iTRAQ技術的蛋白質組學比較分析正常和熱應激肉雞脾臟中的差異表達蛋白質發(fā)現(xiàn),與正常組相比,熱處理組中與先天性免疫應答相關的差異蛋白表達下調.說明熱應激具有免疫敏感性,但不同熱應激條件下免疫相關基因的表達調控作用及免疫應答機理并不相同.動物器官、組織、細胞結構是其生理活動和功能運行的物質基礎,而組織形態(tài)學作為研究組織器官形態(tài)結構的常用方法和技術手段,是直觀、快速檢測外界刺激物對組織形態(tài)影響的最有效方法之一.為了明確熱應激對大鼠脾臟組織發(fā)育的影響,本研究基于HE染色對不同熱激組(38 ℃和43 ℃單激組、38 ℃和43 ℃多激組)脾臟組織形態(tài)學進行比較觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,各熱處理組大鼠脾臟組織中的白髓所占面積減小,而紅髓區(qū)域增多,位于紅髓中的脾竇萎縮,并且相比38 ℃熱激組,在43 ℃熱激組中脾竇的萎縮程度更加嚴重.這與何玉林等[18]在熱應激小鼠及Ren等[19]在冷應激鵪鶉脾臟中的組織形態(tài)學觀察結果相似,表明熱應激可導致大鼠脾臟組織形態(tài)結構發(fā)生改變,并且溫度越高,變化越顯著.此外,本研究發(fā)現(xiàn),38 ℃和43 ℃多激組脾臟中的邊緣區(qū)明顯增加(與單激組相比).邊緣區(qū)處于白髓與紅髓的交界處,細胞排列疏松程度介于紅髓和白髓之間,由巨噬細胞、B細胞、T細胞等構成[20],是脾內免疫應答的主要場所.說明與長時間持續(xù)性熱應激相比,短時間間隔性的熱應激可能對機體的免疫功能起到促進或改善作用.以上結果表明,由熱應激造成的大鼠脾臟組織形態(tài)學結構的改變可能是其免疫機能發(fā)生改變的主要原因,并且由于不同熱應激條件對大鼠脾臟組織形態(tài)學的影響不完全相同,因而對其免疫機能的影響也可能存在差異.

    TLRs基因家族成員(如TLR2和TLR4)在免疫應答,尤其是獲得性免疫應答中扮演十分重要的角色,但是關于其在熱應激中的研究仍然很少,并且在熱應激過程中所發(fā)揮的分子生物學功能尚不明確.為了探究熱應激對大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達模式及其生物學功能的影響,本研究首先通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,TLR2和TLR4在38 ℃熱激組脾臟中的表達量上調.與此研究結果相一致,Quinteiro-Filho等[16]在肉仔雞上研究發(fā)現(xiàn),與常溫組相比,TLR2和TLR4在熱激組(31 ℃)脾臟中的表達量上調.然而,本研究發(fā)現(xiàn),在43 ℃熱激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4的表達又出現(xiàn)顯著下調.這可能是由于不同強度的熱應激對動物機體免疫機能的影響不同所造成.強烈的熱應激可對機體的生長發(fā)育、免疫功能和抗疾病能力產(chǎn)生負面影響,而適度或輕微的熱應激可增強機體的免疫機能,進而提高對外界刺激的耐受性[21].黃長文[22]也研究發(fā)現(xiàn),輕度的熱應激可促進大鼠脾臟源巨噬細胞的吞噬、殺傷和趨化作用,進而增強其免疫機能.由此推測,38 ℃的熱環(huán)境可能在大鼠可以承受的溫度范圍內,在此條件下,脾臟組織可通過上調TLR2和TLR4,進而激活由其介導的免疫相關信號通路,以應對熱應激對脾臟的損傷作用,但當溫度達到一定界限后,脾臟組織結構嚴重受損,尚不能通過免疫應答作用應對這種損傷,使得免疫相關通路被抑制甚至被破壞,從而導致脾臟中TLR2和TLR4表達量降低.此外,與對應的單激組相比,38 ℃多激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達上調,而43 ℃多激組大鼠脾臟中TLR2和TLR4表達下調,這可能是由于在適度的熱應激刺激下,機體的免疫機能增強,并且免疫功能與刺激持續(xù)時間正相關,因而TLR2和TLR4的表達量隨著熱應激持續(xù)時間的延長而增加.然而,與其恰好相反的是,在劇烈的熱應激刺激下,由于脾臟組織嚴重受損,其所執(zhí)行的免疫功能也被嚴重破壞或抑制,因而TLR2和TLR4基因的表達下調,但與長時間持續(xù)性的熱應激相比,短時間的熱應激可以在一定程度上緩解其對脾臟免疫功能的損傷和破壞.

    通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),TLR2和TLR4蛋白陽性信號的表達模式均與其mRNA基本一致,表明熱應激造成TLR2和TLR4基因在轉錄和蛋白水平發(fā)生了相似的表達變化特征.TLR2蛋白陽性反應分布于各處理組紅髓巨噬細胞膜上,并且在對照組和38 ℃熱激組的脾索及各熱激組邊緣區(qū)巨噬細胞膜上也有分布,而TLR4蛋白陽性反應分布于各處理組紅髓及邊緣區(qū)巨噬細胞膜上,并且也存在于對照組和38 ℃熱激組中的白髓巨噬細胞膜上.脾臟組織主要由3部分構成,即白髓、紅髓和邊緣區(qū),每一部分都含有自己獨特的巨噬細胞群,在宿主免疫防御過程中發(fā)揮著不同的功能[23],并且由于巨噬細胞具有“雙刃劍”作用,在不同的環(huán)境條件下被賦予不同的角色和使命.一方面,其可保護組織完整性,并且可吞沒、破壞受損傷的組織,修復組織損傷;另一方面,在某些條件下,也是組織的主要破壞者[24].由此可知,TLR2和TLR4基因可能作為膜型受體,主要參與調控大鼠脾臟巨噬細胞的免疫應答,并且在不同熱應激狀態(tài)下,不同的TLR2和TLR4基因表達模式使其介導的免疫應答過程及其機制不同,因而所發(fā)揮的免疫防御功能存在差異.在38 ℃熱激組中,熱環(huán)境可激活由TLR2和TLR4介導的相應的脾臟巨噬細胞免疫調控通路,進而增強機體的免疫防御機能;而在43 ℃處理組中,由于劇烈的熱環(huán)境使得脾臟原有的正常組織結構及生理功能明顯發(fā)生改變,因而免疫防御機能被抑制或破壞.但是,由TLR2和TLR4所介導的脾臟不同部位巨噬細胞應對熱應激的具體免疫應答分子機制尚需進行更深入的探究.

    猜你喜歡
    脾臟機體基因
    Frog whisperer
    Ω-3補充劑或能有效減緩機體衰老
    中老年保健(2021年7期)2021-08-22 07:40:46
    修改基因吉兇未卜
    奧秘(2019年8期)2019-08-28 01:47:05
    某柴油機機體的設計開發(fā)及驗證
    創(chuàng)新基因讓招行贏在未來
    商周刊(2017年7期)2017-08-22 03:36:21
    大型臥澆機體下芯研箱定位工藝探討
    保留脾臟的胰體尾切除術在胰體尾占位性病變中的應用
    對診斷脾臟妊娠方法的研究
    基因
    腹腔鏡脾切除術與開腹脾切除術治療脾臟占位的比較
    在线观看免费视频网站a站| 交换朋友夫妻互换小说| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黑人猛操日本美女一级片| 在线观看舔阴道视频| 国产高清视频在线播放一区| 女性生殖器流出的白浆| bbb黄色大片| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久狼人影院| 精品福利永久在线观看| 成人18禁在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 黄色女人牲交| 免费人成视频x8x8入口观看| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲一区中文字幕在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91av网站免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久久久久中文| 悠悠久久av| 国产欧美日韩一区二区三| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲精品在线观看二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人手机av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一二三四在线观看免费中文在| 99re在线观看精品视频| cao死你这个sao货| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄色成人免费大全| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 色综合站精品国产| 69精品国产乱码久久久| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜免费成人在线视频| 久久久久久久午夜电影 | 成人永久免费在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线观看日韩欧美| 日韩大尺度精品在线看网址 | 深夜精品福利| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av片天天在线观看| 免费看a级黄色片| 午夜福利免费观看在线| 日本wwww免费看| 在线观看免费高清a一片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 99在线人妻在线中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产成人欧美| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 99国产综合亚洲精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 99riav亚洲国产免费| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美久久黑人一区二区| 久久热在线av| 91在线观看av| 9热在线视频观看99| 好男人电影高清在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费 | 一区二区三区国产精品乱码| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一本综合久久免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 美女大奶头视频| 黄频高清免费视频| 中文字幕色久视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产在线观看jvid| 国产成人影院久久av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 在线观看www视频免费| 亚洲av美国av| 国产成人av教育| 中文字幕高清在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 视频在线观看一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产黄a三级三级三级人| 无人区码免费观看不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品久久久久久成人av| 999精品在线视频| 五月开心婷婷网| 国产麻豆69| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲第一av免费看| 制服诱惑二区| 一级毛片高清免费大全| 男女下面进入的视频免费午夜 | 他把我摸到了高潮在线观看| 一区在线观看完整版| 91精品国产国语对白视频| 国产男靠女视频免费网站| 久久中文字幕一级| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品免费视频内射| www.999成人在线观看| av福利片在线| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利,免费看| 久久久国产成人免费| 99国产精品99久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美色视频一区免费| 热re99久久国产66热| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲人成电影观看| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久av美女十八| 成年人黄色毛片网站| 久久久久久久久中文| 国产在线观看jvid| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久精品国产综合久久久| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久视频播放| 成人精品一区二区免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 制服诱惑二区| 日韩精品中文字幕看吧| 黄片小视频在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 一级片免费观看大全| 精品久久久久久久久久免费视频 | tocl精华| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成人国语在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 99香蕉大伊视频| 香蕉久久夜色| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 中出人妻视频一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品影院久久| a级毛片在线看网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲伊人色综图| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男人舔女人的私密视频| 国产黄色免费在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产真人三级小视频在线观看| 久久性视频一级片| www日本在线高清视频| 亚洲,欧美精品.| 黄色片一级片一级黄色片| 女性被躁到高潮视频| 国产成年人精品一区二区 | 国产精品国产av在线观看| 操出白浆在线播放| www日本在线高清视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品1区2区在线观看.| 在线天堂中文资源库| 中出人妻视频一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 又大又爽又粗| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产一区二区激情短视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲人成77777在线视频| 午夜久久久在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av | 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 香蕉国产在线看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 搡老乐熟女国产| 亚洲精品在线观看二区| 国产欧美日韩一区二区精品| 一级黄色大片毛片| 成在线人永久免费视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄片小视频在线播放| 天天添夜夜摸| 人妻久久中文字幕网| 欧美日韩亚洲高清精品| 交换朋友夫妻互换小说| 咕卡用的链子| 免费高清视频大片| 国产精品一区二区在线不卡| 美女午夜性视频免费| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av五月六月丁香网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产1区2区3区精品| 国产主播在线观看一区二区| 99热国产这里只有精品6| 97人妻天天添夜夜摸| 色综合站精品国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| av天堂在线播放| 在线观看午夜福利视频| 色老头精品视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 老司机福利观看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲黑人精品在线| 无限看片的www在线观看| 亚洲av美国av| 国产av一区在线观看免费| av中文乱码字幕在线| 久久久久国内视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 99国产精品免费福利视频| 精品日产1卡2卡| 精品电影一区二区在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美性长视频在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 在线永久观看黄色视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美性长视频在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人av激情在线播放| 美女午夜性视频免费| 无人区码免费观看不卡| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 少妇的丰满在线观看| 黄色 视频免费看| 久久久久久久久久久久大奶| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜久久久在线观看| av中文乱码字幕在线| 午夜精品在线福利| 国产亚洲av高清不卡| 久久人妻熟女aⅴ| 黄色毛片三级朝国网站| www.999成人在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产野战对白在线观看| 极品人妻少妇av视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 最近最新中文字幕大全免费视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄片播放在线免费| 久久中文看片网| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产av在哪里看| 欧美日韩视频精品一区| 热re99久久精品国产66热6| 啪啪无遮挡十八禁网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 十八禁网站免费在线| 伦理电影免费视频| 午夜福利一区二区在线看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男人舔女人的私密视频| 日韩有码中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 制服诱惑二区| 身体一侧抽搐| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一边摸一边抽搐一进一小说| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本a在线网址| netflix在线观看网站| 日本黄色日本黄色录像| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品美女久久av网站| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产精品999在线| 免费在线观看亚洲国产| 97碰自拍视频| 亚洲欧美激情综合另类| 免费看a级黄色片| 国产成人av教育| 国产高清视频在线播放一区| 在线观看日韩欧美| 午夜视频精品福利| 99热国产这里只有精品6| 不卡一级毛片| 香蕉国产在线看| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日本三级黄在线观看| 美女大奶头视频| 十分钟在线观看高清视频www| 久久人人97超碰香蕉20202| 久9热在线精品视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产黄色免费在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 超碰成人久久| 满18在线观看网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日本a在线网址| 成人永久免费在线观看视频| 天堂中文最新版在线下载| 91九色精品人成在线观看| 国产成人精品在线电影| 亚洲av成人一区二区三| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜日韩欧美国产| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久久久久中文| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丝袜美足系列| 俄罗斯特黄特色一大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲av美国av| 黄色a级毛片大全视频| 久久天堂一区二区三区四区| 久久人妻av系列| 午夜免费观看网址| 国产成人av激情在线播放| 丰满的人妻完整版| 欧美大码av| 免费av毛片视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99re在线观看精品视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲片人在线观看| www.精华液| 两个人免费观看高清视频| 久久伊人香网站| 在线永久观看黄色视频| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲欧美激情综合另类| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲avbb在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 久久国产精品人妻蜜桃| 成年人免费黄色播放视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产av精品麻豆| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 又黄又粗又硬又大视频| 夜夜爽天天搞| 国产精品亚洲一级av第二区| 麻豆国产av国片精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美黄色片欧美黄色片| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 丝袜美足系列| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩精品中文字幕看吧| 又大又爽又粗| 亚洲成人久久性| 操出白浆在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 最好的美女福利视频网| 婷婷丁香在线五月| 欧美午夜高清在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩三级视频一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久香蕉精品热| 欧美成狂野欧美在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | av中文乱码字幕在线| 女人被狂操c到高潮| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 校园春色视频在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲色图综合在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 老司机亚洲免费影院| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久香蕉精品热| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲欧美激情综合另类| 一a级毛片在线观看| 国产高清videossex| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩视频一区二区在线观看| www日本在线高清视频| 麻豆av在线久日| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| www.自偷自拍.com| 欧美日韩一级在线毛片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 老司机福利观看| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品野战在线观看 | 久热爱精品视频在线9| 成人手机av| 好男人电影高清在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区福利在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产xxxxx性猛交| 久久久久精品国产欧美久久久| a级片在线免费高清观看视频| 久久青草综合色| 大陆偷拍与自拍| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲在线自拍视频| 亚洲人成77777在线视频| www日本在线高清视频| 国产成人影院久久av| 欧美一区二区精品小视频在线| 桃色一区二区三区在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 窝窝影院91人妻| 久久中文字幕人妻熟女| 少妇 在线观看| 久久香蕉激情| 美女大奶头视频| 正在播放国产对白刺激| 久久久久久久午夜电影 | 欧美精品一区二区免费开放| 婷婷精品国产亚洲av在线| 校园春色视频在线观看| 91精品三级在线观看| 午夜91福利影院| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 12—13女人毛片做爰片一| 夜夜夜夜夜久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 中文字幕人妻熟女乱码| 日本欧美视频一区| xxx96com| 丝袜美腿诱惑在线| 久久香蕉精品热| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产在线观看jvid| 淫妇啪啪啪对白视频| av在线天堂中文字幕 | 叶爱在线成人免费视频播放| 久久国产精品影院| 精品国产一区二区久久| 国产在线观看jvid| 我的亚洲天堂| 香蕉丝袜av| 国产亚洲av高清不卡| 国产成人av教育| av欧美777| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久中文字幕一级| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品亚洲一级av第二区| bbb黄色大片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 69av精品久久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 看黄色毛片网站| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 久久香蕉精品热| 午夜精品在线福利| 亚洲精品国产区一区二| 一区在线观看完整版| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 最好的美女福利视频网| 亚洲avbb在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久久av美女十八| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产不卡一卡二| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 最新美女视频免费是黄的| 99re在线观看精品视频| 国产高清国产精品国产三级| 99国产综合亚洲精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产亚洲欧美98| 1024香蕉在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜免费激情av| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美不卡视频在线免费观看 | av中文乱码字幕在线| 久久人妻av系列| 午夜亚洲福利在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 人妻久久中文字幕网| 国产精品九九99| 黄色成人免费大全| av片东京热男人的天堂| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久香蕉激情| 无遮挡黄片免费观看| 日本三级黄在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久久国产成人精品二区 | 一本综合久久免费| 制服诱惑二区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 欧美日韩一级在线毛片| 婷婷六月久久综合丁香| 韩国av一区二区三区四区| 国产色视频综合| 亚洲第一av免费看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线观看午夜福利视频| 精品久久久久久,| 精品国内亚洲2022精品成人| 电影成人av| 免费看a级黄色片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美大码av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 脱女人内裤的视频| 夜夜爽天天搞| 免费看a级黄色片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 波多野结衣高清无吗| 9色porny在线观看| 欧美在线一区亚洲| 波多野结衣高清无吗| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美在线一区亚洲| 精品人妻1区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久亚洲真实| 亚洲精品一区av在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费看a级黄色片| 免费在线观看日本一区| 一级片免费观看大全| 亚洲成人免费av在线播放| 看免费av毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产成人免费无遮挡视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 97人妻天天添夜夜摸|