乳腺癌患者乳腺超聲造影參數(shù)與腫瘤組織中PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)的相關(guān)性

陳沛芬，賴瑾瑜，鄺永培

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院超聲科，廣東東莞523059

在女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率及病死率均列首位。乳腺癌的早期診斷可為治療爭(zhēng)取時(shí)機(jī)，改善治療結(jié)局。二維超聲作為乳腺腫塊最主要篩查方式，可有效發(fā)現(xiàn)腫塊存在，但在腫塊良惡性鑒別方面的準(zhǔn)確性欠佳。超聲造影技術(shù)被稱為“超聲技術(shù)的第三次革命”，在腫瘤早期篩查中的敏感性、準(zhǔn)確性均大幅提升[1]。研究顯示，超聲造影參數(shù)上升支斜率、曲線下面積(AUC)等與乳腺癌惡性程度相關(guān)[2-3]。乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、自噬基因表達(dá)量可直接客觀反映細(xì)胞增殖、侵襲、自噬活性，進(jìn)而間接反映乳腺癌的惡性程度[4-5]。增殖基因丙酮酸激酶M2(PKM2)、侵襲基因Gab2、自噬基因ATG2B的表達(dá)水平是腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的量化表現(xiàn)，其水平異?？煞从衬[瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為?；诖?，本研究分析超聲造影參數(shù)與乳腺癌患者惡性生物學(xué)行為相關(guān)基因的相關(guān)性，旨在提升超聲診斷乳腺癌的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年6月—2019年12月在我院接受乳腺手術(shù)治療的120例女性乳腺癌患者作為觀察組，年齡34～75(55.08±7.85)歲。均經(jīng)病理檢查確診，其中浸潤性導(dǎo)管癌111例、導(dǎo)管內(nèi)原位癌9例，臨床分期Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期41例，Ⅳ期30例?；颊呔鶠槭自\，術(shù)前未行抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他組織臟器惡性腫瘤性疾?。蝗焉锲诨虿溉槠?；合并乳腺局部或全身感染性疾病。另選取120例女性乳腺腺纖維瘤患者作為對(duì)照組，年齡31～77(56.12±8.57)歲。兩組年齡具有可比性(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬知情并簽署知情承諾書。

1.2 超聲造影檢查 采用Aplio 500彩色多普勒超聲診斷儀。患者入院后先行二維超聲檢查，了解病灶位置、數(shù)目、大小、內(nèi)部回聲、質(zhì)地、血流灌注、是否合并微鈣化等；固定探頭位置，切換至造影模式，20 mL造影劑Sono Vue與5 mL生理鹽水混勻，抽取4.8 mL經(jīng)肘正中靜脈推注，隨后快速注入5 mL生理鹽水沖管。通過超聲診斷儀觀察病灶處動(dòng)態(tài)灌注，利用Qontrast軟件計(jì)算時(shí)間—強(qiáng)度曲線中達(dá)峰強(qiáng)度(PI)、AUC，其中PI反映微血管密度，AUC反映血流灌注。以二者平均值為界，小于等于平均值為低水平，大于平均值為高水平。

1.3 腫瘤組織PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取凍存的手術(shù)切除腫瘤組織標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液，以3 500 r/min離心10 min，取無色水相。異硫氰酸胍—酚—氯仿一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：PKM2上游5′-ACAGCTGTGTGGTGCTTCTGTG-3′，下游5′-CATTGTCCTCTGTCCAGGCATC-3′；Gab2上游5 ′-CATCATTCACCCTTGGCACAGGTGT-3′，下游5′-TGATCCCAAGTGGTCCACCCCAAC-3′；ATG2B上游5′-CTTGCCCCTTTCGTCTATTTG-3′，下游5′-TACGGCCCTGAAGTACAGTCTT-3′。擴(kuò)增體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μL，寡聚核苷酸引物各為400 nmol/L，探針150 nmol/L，dATP、dCTP和dGTP各200 μmol/L，dUTP 400 μmol/L，10×緩沖液5 μL，MgCl25 mmol/L，TaqDNA聚合酶1.25 U，尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)0.5 U。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；94 ℃ 30 s，66 ℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。在7700 Sequence Detector分析儀上測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本中PKM2、Gab2、ATG2B含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PKM2、Gab2、ATG2B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較 觀察組PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，ATG2B mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

2.2 不同臨床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)水平低于Ⅲ～Ⅳ期，ATG2B mRNA表達(dá)水平高于Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)。見表2。

表1 兩組PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較

表2 不同臨床分期乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較

2.3 兩組超聲造影參數(shù)比較 觀察組PI、AUC均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組超聲造影參數(shù)比較

2.4 不同超聲造影參數(shù)水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較 乳腺癌PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)水平高于低水平患者，ATG2B mRNA表達(dá)量低于低水平患者(P均<0.05)。見表4。

表4 不同超聲造影參數(shù)水平患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平比較

2.5 乳腺癌患者超聲造影參數(shù)與PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)的相關(guān)性 在乳腺癌患者中，PI與PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.518、0.388，P均<0.05)，與ATG2B mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.646，P<0.05)；AUC與PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.506、0.486，P均<0.05)，與ATG2B mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.559，P<0.05)。

3 討論

超聲造影可直觀地觀察乳腺癌惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)生發(fā)展過程中血管構(gòu)筑變化與相應(yīng)血流動(dòng)力學(xué)變化，主要體現(xiàn)在血管數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、空間分布及灌注功能的改變[6-7]。研究顯示，血管生成能力可預(yù)測(cè)良性增生組織的惡性傾向[8-9]。超聲造影參數(shù)時(shí)間—強(qiáng)度曲線中PI動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描開始至腫瘤濃度達(dá)峰所需時(shí)間，反映血管阻力，可反映微血管密度，AUC描述整個(gè)動(dòng)態(tài)增強(qiáng)周期內(nèi)腫瘤組織對(duì)比劑濃度變化趨勢(shì)，可反映病灶組織血流灌注及通透性，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，時(shí)間—強(qiáng)度曲線中PI、AUC逐漸增高[10]。本研究結(jié)果顯示，觀察組超聲造影參數(shù)PI、AUC水平高于對(duì)照組，提示乳腺癌組織中血流灌注更多，與其腫瘤特性相吻合。

乳腺癌細(xì)胞惡性增殖與促增殖/抗增殖基因表達(dá)失衡直接相關(guān)，對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，可反映乳腺癌細(xì)胞的增殖活性，評(píng)估其惡性程度[11]。PK是細(xì)胞糖酵解通路的限速酶，也是腫瘤代謝異常的關(guān)鍵酶。PK有四種同工酶形式(M1、M2、L、R)，在腫瘤形成過程中，其他三種同工酶逐漸消失，PKM2則大量表達(dá)。腫瘤細(xì)胞PKM2的酪氨酸與絲氨酸位點(diǎn)會(huì)發(fā)生磷酸化，PKM2上磷酸酪氨酸可促進(jìn)1，6二磷酸果糖釋放，四聚體轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w，進(jìn)而使糖酵解向生物合成轉(zhuǎn)變，加速有氧糖酵解，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[12]。研究顯示，腫瘤組織中PKM2高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄輔助因子可參與細(xì)胞耐藥及有絲分裂、增殖周期調(diào)節(jié)，下調(diào)PKM2表達(dá)可對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組乳腺癌組織中PKM2 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，且臨床分期Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者PKM2 mRNA表達(dá)水平低于Ⅲ～Ⅳ期，表明PKM2表達(dá)異常參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤惡性進(jìn)展后可出現(xiàn)遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不佳，該過程有較多侵襲相關(guān)基因參與。Gab2是腫瘤相關(guān)蛋白，在卵巢癌、卵巢癌等中呈異常高表達(dá)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。研究表明，Gab2可通過PI3K/Akt/ARK5信號(hào)通路影響基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[16]。自噬功能異常是癌癥發(fā)生的重要因素之一。ATG2B是典型的自噬相關(guān)基因，可調(diào)控溶酶體降解受損細(xì)胞器和大分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)程[17]。本研究結(jié)果顯示，觀察組Gab2 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期患者；ATG2B mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，且Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期患者。這表明Gab2、ATG2B表達(dá)異常與乳腺癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

探討超聲造影與分子生物學(xué)指標(biāo)的聯(lián)系，可對(duì)臨床治療和預(yù)后評(píng)估方面提供更全面的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌超聲造影PI、AUC高水平患者PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)高于低水平患者，ATG2B mRNA表達(dá)低于低水平患者，且PI、AUC水平與PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，與ATG2B mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示超聲造影參數(shù)水平與乳腺癌患者PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)水平相關(guān)，可在一定程度上反映乳腺癌細(xì)胞的增殖活性、侵襲活性及自噬活性。

綜上所述，乳腺癌患者超聲造影參數(shù)水平及PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)異于良性腫瘤者，且具體參數(shù)水平與PKM2、Gab2、ATG2B mRNA表達(dá)量直接相關(guān)，可作為早期篩查疾病、評(píng)估惡性程度的可靠手段。降低PKM2、Gab2 mRNA表達(dá)，提高ATG2B mRNA表達(dá)有望成為控制乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)。