幼羊和成年羊顱骨縫線處硬腦膜組織中差異表達(dá)基因的篩選及其生物學(xué)功能分析

葉小健，馮士軍，張春陽(yáng)，邵國(guó)，王孟輝，高巖,張小璐，王悅，寇正雄

1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；4內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心；5深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心

頭部外傷是導(dǎo)致小兒傷殘和死亡的主要原因之一。小兒顱骨缺損在3 cm內(nèi)可自行修復(fù)，超過(guò)3 cm則需人工修補(bǔ)。由于小兒顱骨處在生長(zhǎng)階段，傳統(tǒng)修補(bǔ)方法術(shù)后并發(fā)癥甚多，國(guó)內(nèi)外對(duì)修補(bǔ)材料的選擇、修補(bǔ)的時(shí)機(jī)、并發(fā)癥的防治均無(wú)統(tǒng)一共識(shí)。胚胎期顱骨是由32塊不規(guī)則骨通過(guò)93個(gè)纖維關(guān)節(jié)(顱骨縫線)連結(jié)組成，出生后則融合成23塊。在顱骨發(fā)育過(guò)程中，縫線邊緣的細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，其分泌的骨基質(zhì)逐漸添加到縫線處，通過(guò)骨化在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)閉合。這些纖維縫線在發(fā)育中的顱骨之間充當(dāng)靈活的關(guān)節(jié)，在出生后保持通暢以適應(yīng)顱骨擴(kuò)張，對(duì)顱骨塑形起關(guān)鍵作用。保持縫線邊緣成骨前緣的生長(zhǎng)需要在增殖和分化之間保持平衡，過(guò)早礦化閉合會(huì)導(dǎo)致狹顱癥。硬腦膜與顱骨直接接觸，與顱骨存在著壓力傳遞和物質(zhì)的交流，對(duì)顱骨的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。鑒于發(fā)育期大腦的快速生長(zhǎng)，為保持縫線為非骨化的生長(zhǎng)中心，需要硬腦膜產(chǎn)生具有生物活性的信號(hào)物質(zhì)對(duì)顱骨縫線進(jìn)行調(diào)節(jié)，而這種調(diào)節(jié)需要未發(fā)育成熟的硬腦膜參與。研究顯示，在顱骨缺損時(shí)，將來(lái)自成熟動(dòng)物的硬腦膜替代未成熟硬腦膜時(shí)，沒(méi)有發(fā)生骨再生；而將未成熟硬腦膜替代成熟動(dòng)物的硬腦膜時(shí)，發(fā)生了骨再生[1]。這表明未成熟硬腦膜在顱骨生長(zhǎng)和損傷修復(fù)中具有重要作用，但縫線處未成熟硬腦膜參與發(fā)育期顱骨生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制目前尚不明確。2020年12月—2021年5月，我們通過(guò)生物信息學(xué)方法，尋找成年羊及幼羊顱骨縫線處硬腦膜影響顱骨生長(zhǎng)的差異表達(dá)基因及其相關(guān)信號(hào)通路，旨在為顱骨缺損及顱縫早閉提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 于包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入12只普通級(jí)雄性健康小尾寒羊，其中51日齡幼羊6只，體質(zhì)量(4.5±0.5)kg；12月齡成年羊6只，體質(zhì)量(48.0±2.5)kg。

1.2 標(biāo)本采集與基因檢測(cè) 于包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科實(shí)驗(yàn)室對(duì)羊硬腦膜取樣，將頂額縫及矢狀縫處硬腦膜與顱骨分離并標(biāo)記，送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行總RNA的提取、純化、cDNA文庫(kù)構(gòu)建、庫(kù)檢、轉(zhuǎn)錄組上機(jī)測(cè)序等一系列處理，處理后返還轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。通過(guò)去除測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、不確定剪堿基較高序列、長(zhǎng)度過(guò)短序列，共獲得49.97 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到5.97 Gb以上，Q30堿基百分比在94.37%以上。參考基因來(lái)源：Ovis_aries；參考基因組版本：Oar_v3.1；參考基因組來(lái)源：http://asia.ensembl.org/Ovis_aries/Info/Index。分別將各樣品的Clean Reads與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率為62.9%～92.8%。

1.3 幼羊與成年羊硬腦膜組織中差異表達(dá)基因的篩選 以成年羊頂額縫、矢狀縫硬腦膜組織基因測(cè)序結(jié)果為對(duì)照，對(duì)幼羊頂額縫、矢狀縫硬腦膜組織基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用DEGSeq2軟件，上調(diào)和下調(diào)的差異倍數(shù)設(shè)置為2.0，校正后的P設(shè)置為0.001，多重檢驗(yàn)方法設(shè)置為BH。共獲得上調(diào)的兩個(gè)基因集和下調(diào)的兩個(gè)基因集，分別兩兩行維恩分析，取共有的差異表達(dá)基因作為幼羊和成年羊硬腦膜組織差異表達(dá)基因。

1.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析 將獲得的差異表達(dá)基因與六大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)進(jìn)行比對(duì)，全面獲得基因的注釋信息并對(duì)各數(shù)據(jù)庫(kù)注釋情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。用Goatoos軟件對(duì)基因集進(jìn)行GO富集分析，使用方法為Fisher精確檢驗(yàn)，當(dāng)校正后的P<0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能存在顯著富集情況。分別在上調(diào)及下調(diào)基因的富集分析中尋找與顱骨發(fā)育相關(guān)的GO功能，上調(diào)基因GO功能中可見(jiàn)骨的礦化(包含15個(gè)基因)，下調(diào)基因GO功能中可見(jiàn)骨的礦化正向調(diào)節(jié)(包含5個(gè)基因)。采用R腳本對(duì)上調(diào)的15個(gè)基因及下調(diào)的5個(gè)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析(與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比)，當(dāng)校正后的P<0.05時(shí)，認(rèn)為此KEGG信號(hào)通路存在顯著富集。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)篩選出可能與顱骨發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路。

1.5 差異表達(dá)基因的驗(yàn)證 在上調(diào)基因中選取上調(diào)最多的前6位基因和下調(diào)基因中下調(diào)最多的前2位基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。取凍存的幼羊和成年羊頂額縫及矢狀縫處硬腦膜組織，研磨后，用TRIzol法提取總RNA，通過(guò)Nano-drop2000測(cè)定值計(jì)算純度，均在2.0～2.2。按照試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用ABI7900型熒光定量PCR儀，SYBRGreen熒光染料為PCR反應(yīng)原料，反應(yīng)體系參考說(shuō)明書。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參，2-ΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 幼羊與成年羊頂額縫、矢狀縫硬腦膜組織中的差異表達(dá)基因 與成年羊頂額縫硬腦膜組織相比，幼羊頂額縫硬腦膜組織中的上調(diào)基因有1 280個(gè)，下調(diào)基因有1 209個(gè)；與成年羊矢狀縫硬腦膜組織相比，幼羊矢狀縫硬腦膜組織中的上調(diào)基因有2 089個(gè)，下調(diào)基因有1 891個(gè)。對(duì)上述差異表達(dá)基因分別兩兩行維恩分析，獲得共有的差異表達(dá)基因765個(gè)，其中上調(diào)基因417個(gè)，下調(diào)基因348個(gè)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果 對(duì)幼羊與成年羊硬腦膜組織中差異表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行GO功能富集后可見(jiàn)骨的礦化，對(duì)差異表達(dá)下調(diào)基因集進(jìn)行GO功能富集后可見(jiàn)骨的礦化正向調(diào)節(jié)，見(jiàn)表1、表2。在上調(diào)基因中，骨的礦化包含15個(gè)基因，分別為ENPP1、HIF1A、IBSP、MMP-13、PTN、OMD、COL1A2、BGLAP、FBN2、ASPN、TMEM119、RFLNB、PHOSPHO1、LOX、ISG15；在下調(diào)基因中，骨的礦化正向調(diào)節(jié)包含5個(gè)基因，分別為ISG15、OSR1、骨形態(tài)蛋白4(BMP-4)、BMP-6、BMP-7。KEGG信號(hào)通路分析顯示，骨的礦化基因主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路，骨的礦化正向調(diào)節(jié)基因主要涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)通路，見(jiàn)表3、表4。

表1 幼羊與成年羊硬腦膜組織中差異表達(dá)上調(diào)基因的GO功能富集分析結(jié)果(前20位)

表2 幼羊與成年羊硬腦膜組織中差異表達(dá)下調(diào)基因的GO功能富集分析結(jié)果(前20位)

表3 骨的礦化基因集KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果

2.3 幼羊與成年羊硬腦膜組織差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果 在上調(diào)基因中選取上調(diào)最多的前6位基因COL1A2、MMP-13、PHOSPHO1、IBSP、OMD、PTN和下調(diào)基因中下調(diào)最多的前2位基因BMP-4、BMP-6進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。同一縫線處幼羊和成年羊各差異基因表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，與測(cè)序結(jié)果相符。

表4 骨的礦化正向調(diào)節(jié)基因集KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果

表5 幼羊與成年羊頂額縫處硬腦膜組織中差異表達(dá)基因的表達(dá)水平比較

表6 幼羊和成年羊矢狀縫處硬腦膜組織中差異表達(dá)基因的表達(dá)水平比較

3 討論

顱骨縫線作為顱骨生長(zhǎng)的信號(hào)中心，在出生后保持通暢以適應(yīng)顱骨擴(kuò)張，硬腦膜和縫線為顱骨發(fā)育提供了重要的調(diào)節(jié)信號(hào)。硬腦膜是發(fā)育期顱骨生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)因素。硬腦膜與顱骨直接接觸，其與顱骨必然存在著壓力傳遞和物質(zhì)的交流。在顱骨發(fā)育早期，顱骨與硬腦膜的相互作用對(duì)顱骨的生長(zhǎng)發(fā)育是必要的；在顱骨發(fā)育后期，硬腦膜控制顱骨的生長(zhǎng)模式和縫線的開(kāi)放及閉合[2]。

硬腦膜對(duì)縫線是否閉合也有重要影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)8日齡(額后縫閉合之前)大鼠進(jìn)行自體移植手術(shù)，將額后縫和冠狀縫重新定位在非縫線處的硬腦膜區(qū)域，結(jié)果顯示，冠狀縫的閉合未受影響；但在額后縫處，原位組(顱骨與硬腦膜分離且處于原位)相對(duì)于旋轉(zhuǎn)45°移位組和旋轉(zhuǎn)90°移位組的骨質(zhì)厚度明顯增加，且離原縫線處硬腦膜越遠(yuǎn)，顱縫閉合越早[3]。將第19天的胎鼠和第1天的新生大鼠冠狀縫線(包括相關(guān)的額骨和頂骨)移植到成年大鼠頂骨的中心，發(fā)現(xiàn)硬腦膜的保留對(duì)縫線閉合起到關(guān)鍵作用，胎鼠和新生大鼠縫線均保持開(kāi)放狀態(tài)2周；然而在第3周，在沒(méi)有移植硬腦膜的情況下，縫線被骨覆蓋發(fā)生閉合，而存在硬腦膜的縫線處骨化延遲[4]。這表明硬腦膜對(duì)縫線的開(kāi)放及閉合具有調(diào)控作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于成年羊，幼羊顱骨縫線處硬腦膜骨的礦化相關(guān)基因(ENPP1、HIF1A、IBSP、MMP-13、PTN、OMD、COL1A2、BGLAP、FBN2、ASPN、TMEM119、RFLNB、PHOSPHO1、LOX、ISG15)是上調(diào)的；骨的礦化正向調(diào)節(jié)相關(guān)基因(ISG15、OSR1、BMP-4、BMP-6、 BMP-7)是下調(diào)的。上調(diào)基因中COL1A2是礦化的骨架，IBSP通過(guò)與COL1A2結(jié)合，在礦化的早期發(fā)揮著主要作用；PHOSPHO1可以促進(jìn)礦物晶體的沉積。下調(diào)的骨的礦化正向調(diào)節(jié)基因主要為BMP家族，BMP是骨骼發(fā)育和維持成人骨穩(wěn)態(tài)所必需的蛋白，目前已經(jīng)確認(rèn)的BMP家族成員達(dá)數(shù)十個(gè)，其中BMP-4、BMP-6、BMP-7均具有成骨的作用。

對(duì)骨的礦化相關(guān)基因集進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，其中有PI3K/Akt信號(hào)通路。PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和分化等行為的關(guān)鍵途徑之一，這一途徑通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的存活和分化來(lái)維持骨量，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[5-6]。在體外，WNT3a和肝素激活PI3K/Akt信號(hào)通路激活成骨細(xì)胞分化[7]，PI3K(P85α)通過(guò)抑制MAPK通路的激活在成骨細(xì)胞分化中起重要作用[8]；在體內(nèi)，在敲除Akt抑制基因Ptenin后小鼠成骨細(xì)胞分化和骨密度增加[9]。敲除間充質(zhì)細(xì)胞中Akt1后，Runx2表達(dá)增加并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[10]。PI3K/Akt通路在破骨細(xì)胞形成中也起重要作用。新近研究顯示，Akt的激活通過(guò)激活GSK3β/NFAtc1信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[11]。因此顱骨縫線作為顱骨的生長(zhǎng)中心，該處硬腦膜可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)顱骨的生長(zhǎng)。

在顱骨發(fā)育過(guò)程中，顱骨結(jié)締組織框架經(jīng)歷膜內(nèi)骨化形成顱骨。隨著顱骨前進(jìn)以包裹大腦，在顱骨板之間形成纖維縫線。通過(guò)顱骨縫線復(fù)合體內(nèi)的一系列組織相互作用，大腦的擴(kuò)張與顱骨生長(zhǎng)相結(jié)合。顱骨融合癥或顱骨縫線過(guò)早融合可導(dǎo)致顱骨形狀異常，引起失明、智力低下。硬腦膜對(duì)顱骨縫線的閉合起著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析及PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，骨的礦化正向調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)是下調(diào)的，主要包含BMP相關(guān)基因。對(duì)下調(diào)的基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，BMP基因主要通過(guò)TGF-β信號(hào)通路發(fā)揮作用。BMP是骨骼發(fā)育和維持成人骨穩(wěn)態(tài)所必需的蛋白，能夠誘導(dǎo)骨形成。成熟的BMP分子是依賴半胱氨酸二硫鍵固定的雙鏈多肽二聚體分子，其重要結(jié)構(gòu)中40%～50%與TGF-β高度同源，是TGF-β超家族中最重要的成員。目前已確認(rèn)的BMP家族成員達(dá)到40多個(gè)，其中BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9均有促進(jìn)成骨作用[12-13]。BMP和TGF-β與各自細(xì)胞膜上的Ⅱ型受體結(jié)合后，進(jìn)一步將信號(hào)共同傳遞到細(xì)胞內(nèi)Smad分子上，使Smad分子與coSMAD結(jié)合。R-SMAD/coSMAD復(fù)合體作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)聚集在Runx2、Osterix基因上，控制間充質(zhì)細(xì)胞的分化。BMP與TGF-β信號(hào)的相互調(diào)控對(duì)骨骼的生長(zhǎng)起著重要作用[14]。WARREN等[15]研究認(rèn)為，BMP的拮抗劑noggin在未閉合的顱縫下硬腦膜中特異性表達(dá)，并且硬腦膜為其唯一來(lái)源。ATSAWASUWAN等[16]報(bào)道，DICER缺陷小鼠的額后縫和畸形的顱骨完全融合，對(duì)融合的顱骨基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，縫線和顱骨生長(zhǎng)相關(guān)基因TGF-β家族、BMP-3、MSX2、ALX4、Runx2和OSX的表達(dá)顯著增加。在顱縫早閉患者中，其顱縫處TGF-β2明顯上調(diào)[17]。組織學(xué)研究顯示，84日齡兔接受抗TGF-β2抗體治療后，與對(duì)照組相比，其冠狀縫線開(kāi)放且顯著，縫線面積更大[18]。以上文獻(xiàn)均證實(shí)TGF-β對(duì)顱骨縫線起著重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于成年羊，幼羊顱骨縫線處的BMP表達(dá)下調(diào)，通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)起主要作用的信號(hào)通路為TGF-β信號(hào)通路。由此推測(cè)，硬腦膜處的BMP通過(guò)影響TGF-β信號(hào)通路來(lái)調(diào)控顱骨縫線的閉合。

最后我們通過(guò)熒光定量PCR方法對(duì)生物信息學(xué)方法篩選出來(lái)的幼羊與成年羊顱骨縫線處硬腦膜組織差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，相對(duì)于成年羊，幼羊顱骨縫線處硬腦膜組織中骨的礦化相關(guān)基因MMP-13、PTN、OMD、COL1A2、PHOSPHO1、IBSP表達(dá)是上調(diào)的，骨的礦化正向調(diào)節(jié)相關(guān)基因BMP-4、BMP-6表達(dá)是下調(diào)的，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相符。

綜上所述，幼羊及成年羊顱骨縫線處硬腦膜組織中存在大量差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)的骨的礦化相關(guān)基因MMP-13、PTN、OMD、COL1A2、PHOSPHO1、IBSP可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)顱骨的生長(zhǎng)，下調(diào)的BMP基因可能通過(guò)TGF-β信號(hào)通路來(lái)控制顱骨縫線的閉合。這為顱骨缺損與修補(bǔ)及顱縫早閉的治療提供了新思路，同時(shí)也讓我們更好地了解硬腦膜影響顱骨生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制。