柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定尼莫地平注射液中的甲醛和乙醛

顧曉風(fēng)，楊袁，郝剛，唐倩倩

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇蘇州 215104；2.山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺(tái) 264670）

尼莫地平為第2 代二氫吡啶類(lèi)Ca2+拮抗劑，其注射劑是預(yù)防和治療動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣引起的缺血性神經(jīng)損傷的首選藥［1–2］。尼莫地平為難溶性藥物，處方中可通過(guò)添加聚乙二醇400 提高尼莫地平的溶解性。聚乙二醇為環(huán)氧乙烷和水縮聚而成的混合物，具有以氧乙烯基為重復(fù)單位組成的線(xiàn)性鏈狀結(jié)構(gòu)，常作為助溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑應(yīng)用于藥物制劑中，屬于高風(fēng)險(xiǎn)性藥用輔料［3］。《中國(guó)藥典》定義藥用輔料為生產(chǎn)藥品和調(diào)配處方時(shí)使用的賦形劑和附加劑，與藥物的不相容性表現(xiàn)在其本身與藥物的反應(yīng)及輔料中的雜質(zhì)與藥物的反應(yīng)，可能對(duì)制劑的質(zhì)量、安全性和有效性產(chǎn)生影響［4–5］。聚乙二醇類(lèi)藥用輔料為聚氧乙烯的大分子聚合物，受光照或金屬離子催化時(shí)會(huì)發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成甲醛和乙醛等小分子雜質(zhì)［6］，這些雜質(zhì)可能與尼莫地平中的敏感官能團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)，引發(fā)主藥的降解；同時(shí)，甲醛和乙醛均被世界衛(wèi)生組織公布為1 級(jí)致癌物質(zhì)，在體內(nèi)會(huì)增加氧化應(yīng)激和氧化損傷，引起基因突變、染色體損傷，甚至引起嚴(yán)重的染色體重排，導(dǎo)致各種血癌［7］。按照自氧化反應(yīng)的機(jī)理，制成制劑后，聚乙二醇類(lèi)藥用輔料的自氧化反應(yīng)并不會(huì)停止，而隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，制劑中甲醛和乙醛含量可能會(huì)比輔料中含量有所提高，故控制制劑中甲醛和乙醛的含量，對(duì)有效控制高風(fēng)險(xiǎn)制劑的安全性有重要意義。

《中國(guó)藥典》2020 年版采用紫外衍生化法測(cè)定聚乙二醇類(lèi)藥用輔料中甲醛的含量，對(duì)乙醛未作控制［3］。添加了聚乙二醇類(lèi)藥用輔料的制劑，對(duì)其中降解產(chǎn)物甲醛和乙醛的測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。測(cè)定原料藥、藥用輔料、食品等中甲醛含量的方法有分光光度法［8–9］、氣相色譜法［10–11］、液相色譜法［12–15］、離子色譜法［16］等。分光光度法易受其它雜質(zhì)如烯烴等物質(zhì)的干擾，專(zhuān)屬性不強(qiáng)；離子色譜法儀器昂貴，普及性不如氣相和液相色譜法。

筆者嘗試用頂空氣相色譜法測(cè)定尼莫地平注射液中甲醛和乙醛的含量，結(jié)果表明乙醛色譜響應(yīng)較差，方法靈敏度達(dá)不到要求，故采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）進(jìn)行柱前衍生化后以高效液相色譜法測(cè)定，該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC–2010CHT 型，附帶LC Solution 工作站，日本島津公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒–托利多公司。

乙腈：色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司。

2，4-二硝基苯肼：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

鹽酸：優(yōu)級(jí)純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

乙醇：色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司。

枸櫞酸、枸櫞酸鈉：均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

甲醛水溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：100 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)為BW 20040–100–W–20，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

乙醛對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

尼莫地平對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

尼莫地平注射液樣品：規(guī)格為10 mg（50 mL），德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，由密理博純水儀制得。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈–水（體積比為50∶50），流量為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.3 溶液配制

1.3.1 衍生化溶液

取2，4-二硝基苯肼0.2 g，置于50 mL 棕色容量瓶中，加入乙腈約40 mL 及鹽酸3 mL，超聲10 min 使2，4-二硝基苯肼溶解，放冷，用乙腈稀釋至標(biāo)線(xiàn)。臨用新制。

1.3.2 甲醛和乙醛混合對(duì)照品儲(chǔ)備液

取甲醛水溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和乙醛對(duì)照品適量，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為10.0，12.0 μg/mL 的甲醛和乙醛混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3 甲醛、乙醛系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密移取甲醛和乙醛混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 mL，分別 置于10 mL 容 量瓶中，加入乙腈1 mL，搖勻，再加入1 mL 衍生化溶液，搖勻，置于暗處，于室溫下反應(yīng)30 min，用乙腈稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻，制得甲醛質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 μg/mL，乙醛質(zhì)量濃度分別為0.012、0.024、0.06、0.12、0.6、1.2 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4 樣品溶液

精密移取尼莫地平注射液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入乙腈1 mL，搖勻，再加入1 mL 衍生化溶液，搖勻，置于暗處，于室溫下反應(yīng)30 min，用乙腈稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻。

1.3.5 空白對(duì)照溶液

按處方取尼莫地平、乙醇、枸櫞酸、枸櫞酸鈉，配制不含有聚乙二醇400 的空白溶液。取空白溶液2 mL，置于10 mL 容量瓶中，按1.3.4 方法進(jìn)行衍生化，作為空白對(duì)照溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取甲醛和乙醛系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液，按1.2 色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，建立甲醛和乙醛的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中甲醛和乙醛的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的選擇

由于缺少發(fā)色基團(tuán)，甲醛和乙醛需借助衍生化試劑生成衍生化產(chǎn)物。目前最常用的紫外衍生化試劑是2，4-二硝基苯肼（DHPH）。在偏酸性條件下，DHPH 與甲醛、乙醛反應(yīng)，分別生成甲醛–2，4-二硝基苯腙（甲醛–DNPH）和乙醛–2，4-二硝基苯腙（乙醛–DNPH），該類(lèi)化合物于350～380 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)紫外吸收，結(jié)合高效液相色譜分離技術(shù)，可建立具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)方法。

分別使用0.5、1、2 mL 衍生化溶液，考察衍生化試劑用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用1 mL衍生化溶液所得色譜峰面積大于使用0.5 mL 衍生化溶液樣品的色譜峰面積，而與使用2 mL 衍生化溶液相比，樣品色譜峰面積無(wú)顯著性差異，故選擇使用1 mL 衍生化溶液.

分別將樣品置于室溫和45 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min 和45 min，考察衍生化反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明于室溫反應(yīng)30 min，即可反應(yīng)完全，故確定衍生化條件為加入1 mL 衍生化溶液，置于暗處室溫下反應(yīng)30 min。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

衍生化產(chǎn)物甲醛–DNPH 的乙腈溶液在350 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，乙醛–DNPH 的乙腈溶液則在360 nm 波長(zhǎng)處有最大紫外吸收，試驗(yàn)結(jié)果表明兩個(gè)波長(zhǎng)下樣品的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，結(jié)合文獻(xiàn)［7］，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2.2.2 色譜柱

參考文獻(xiàn)［7］［14］分別考察C8和C18色譜柱，試驗(yàn)結(jié)果表明，常見(jiàn)的C8和C18色譜柱均能將目標(biāo)物完全分開(kāi)，而C18色譜柱目標(biāo)物峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，拖尾因子較C8色譜柱大，故選擇C8柱。比較了Agilent zorbax C8和Waters XBridge C8色譜柱，后者色譜峰形更加對(duì)稱(chēng)尖銳，故選擇Waters XBridge C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為實(shí)驗(yàn)用色譜柱。

2.2.3 流動(dòng)相

文獻(xiàn)報(bào)道多以乙腈–水系統(tǒng)為流動(dòng)相測(cè)定甲醛–DNPH 和乙醛–DNPH。分別考察不同配比的乙腈與水作為流動(dòng)相的分離分析效果，結(jié)果表明當(dāng)乙腈與水體積比為65∶35 時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)峰在5 min內(nèi)出峰，甲醛–DNPH 峰與衍生化試劑峰分離度僅為1.5；當(dāng)乙腈–水體積比為35∶65 時(shí)，甲醛–DNPH峰和乙醛–DNPH 峰的保留時(shí)間分別為16.4 min和24.4 min，峰形明顯展寬；當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為45%～55%時(shí)，均能得到峰形對(duì)稱(chēng)、分離度良好的色譜峰，故選擇乙腈與水的體積比為50∶50。

2.2.4 柱溫

分別考察柱溫30、35、40℃對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明除保留時(shí)間略有不同外，測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，故選擇柱溫為30 ℃。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取空白對(duì)照溶液、甲醛質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 和乙醛質(zhì)量濃度為0.12 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、樣品溶液各20 μL，分別注入色譜儀，按1.2 色譜條件測(cè)定，色譜圖如圖1 所示。結(jié)果表明，衍生化產(chǎn)物甲醛–DNPH 峰和乙醛–DNPH 峰的理論板數(shù)均大于10 000，拖尾因子小于1.2，分離度大于5.0。尼莫地平及其它物質(zhì)對(duì)甲醛–DNPH 峰和乙醛–DNPH 峰的測(cè)定均無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.4 線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

取甲醛、乙醛系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照質(zhì)量濃度從低到高依次進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度X（μg/mL）為自變量、色譜峰面積Y為因變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

取甲醛質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 和乙醛質(zhì)量濃度為0.12 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，逐級(jí)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定并記錄色譜峰面積。以信噪比3∶1 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。

甲醛、乙醛的質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限列于表1。

表1 甲醛、乙醛的質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由表1 可知，甲醛、乙醛的質(zhì)量濃度分別在0.01～1.00 μg/mL 及0.01～1.20 μg/mL 范圍與色譜峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均為0.999 9。該法測(cè)定甲醛、乙醛的檢出限分別為0.003、0.004 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6 份，按1.3.4 方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定后記錄色譜圖，用色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量，甲醛、乙醛的質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，甲醛、乙醛測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.86%、1.02%，表明本方法測(cè)量精密度良好，滿(mǎn)足分析要求。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取甲醛、乙醛質(zhì)量濃度分別為0.1、1.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密移取樣品1.0 mL，置于10 mL 容量瓶中，平行制備9 份，每3 份一組，每組分別精密加入上述甲醛和乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6、1.0、1.4 mL，再加入1 mL 衍生化溶液，搖勻，置于暗處于室溫下反應(yīng)30 min，用乙腈稀釋至標(biāo)線(xiàn)，搖勻后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果列于表3。由表3 可知，3 個(gè)加標(biāo)水平甲醛、乙醛的平均加標(biāo)回收率分別為104.3%、92.0%，表明本方法測(cè)量準(zhǔn)確度較高，滿(mǎn)足分析要求。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了柱前衍生化HPLC 法，對(duì)尼莫地平注射液中的甲醛、乙醛進(jìn)行測(cè)定，方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確度高。該法有助于指導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)選擇更優(yōu)質(zhì)的藥用輔料，以提高藥物的安全性。