外源無機砷形態(tài)對蜈蚣草中砷和植物營養(yǎng)元素微區(qū)分布的影響研究

龔雪剛，吳亮亮，楊越晴

(礦冶科技集團有限公司 環(huán)境工程研究設(shè)計所，北京 100160)

砷(As)作為環(huán)境中一種普遍存在的有毒類金屬元素，具有高毒、致癌、致畸作用，是我國68種優(yōu)先控制污染物之一[1]。然而，隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和礦業(yè)活動的加劇，我國土壤As污染問題愈發(fā)嚴(yán)重。據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國實際調(diào)查的630萬km2土壤中，As超標(biāo)點位占2.7%，累計污染面積達(dá)17萬km2。此外，我國西南和華南地區(qū)均出現(xiàn)了大面積區(qū)域的土壤As污染問題，并對居民健康安全造成了嚴(yán)重威脅[2-4]。

蜈蚣草(PterisvittataL.)作為最早被發(fā)現(xiàn)和報道的砷超富集植物，具有極強的砷吸收和轉(zhuǎn)運富集能力以及細(xì)胞耐砷抗砷性，是一種極為有效的砷污染土壤修復(fù)植物[5-7]。為有效了解蜈蚣草的富砷機理，國內(nèi)外學(xué)者從植物生理、生物化學(xué)、分子機制等多方面開展了大量研究，重點提出了砷酸還原、液泡區(qū)隔化和抗氧化脅迫等砷解毒和砷超富集作用機制[8-10]，這為人們深入認(rèn)識和了解蜈蚣草吸收和富集砷的行為過程提供了重要的理論基礎(chǔ)。然而，也有研究指出相關(guān)營養(yǎng)元素會對蜈蚣草吸收和累積As的能力產(chǎn)生影響[7，11-12]，但對于營養(yǎng)元素與As在蜈蚣草中的交互作用，特別是元素微區(qū)分布與As富集間的作用關(guān)系研究鮮有涉及[13-14]。

元素微區(qū)分布研究一方面可以直觀反映目標(biāo)元素在植物體向頂運輸過程中的運移途徑和賦存特征[15-16]，同時還有助于探究植物體內(nèi)元素間的交互作用，對深入揭示植物重金屬耐受、解毒等機制具有重要意義[17-18]。因此，本文擬通過同步輻射微區(qū)X射線熒光(μ-SRXRF)分析手段，研究不同形態(tài)As處理蜈蚣草中營養(yǎng)元素和As向頂運輸過程中在不同組織部位的分布和賦存規(guī)律，揭示外源無機As對蜈蚣草體內(nèi)營養(yǎng)元素和As微區(qū)分布的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

將采自湖南郴州市的蜈蚣草孢子均勻撒在播種盤基質(zhì)中(花卉土∶蛭石=1∶1)，灑水保持濕潤，覆薄膜保濕，置于溫室內(nèi)培育，室內(nèi)晝間溫度25 ℃，夜間溫度20 ℃，濕度65%。當(dāng)孢子發(fā)育出數(shù)片幼葉時，分苗移栽到1/5強度的霍格蘭營養(yǎng)液(pH=6.0)中進(jìn)行培養(yǎng)。3～6個月后，選取長勢優(yōu)良且相似的蜈蚣草苗備用。

試驗共設(shè)計三組處理：空白對照(A)、三價砷(B)、五價砷(C)。每組處理設(shè)置三個重復(fù)。三價砷和五價砷分別由亞砷酸鈉和砷酸鈉配制，配置濃度為10 mg/L。為保證不同砷形態(tài)處理的有效性，每三天換一次營養(yǎng)液[19]，4個周期共12 d后將蜈蚣草收獲。將收獲的蜈蚣草用去離子水洗凈，鮮樣保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 μ-SRXRF原位分析

蜈蚣草鮮樣組織橫截面的同步輻射微區(qū)X射線熒光面掃描分析(μ-SRXRF)在上海同步輻射裝置硬X 射線微聚焦及應(yīng)用光束線站BL15U1 進(jìn)行，掃描模式設(shè)置為熒光模式。試驗采用入射光能量12 keV，掃描步長30～50 μm，每點的掃描測量時間為2 s。分析元素的XRF信號采用硅漂移探測器(Vortex-90EX，SII，USA)收集，主要包括As、Ca、Cu、Fe、Mn、P、S、Zn和Compton散射。同時為校正同步輻射束流變化對熒光信號強度的影響，采集的元素?zé)晒鈴姸染鑼θ肷涔鈴姸群虲ompton散射作歸一處理。校正后的熒光強度即表示相應(yīng)元素的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

同步輻射微區(qū)掃描數(shù)據(jù)利用Igor Pro 5.01軟件進(jìn)行處理并用Origin 8.0 軟件繪制元素?zé)晒釳apping圖，相應(yīng)的Mapping熒光數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0(SPSS Inc，Chicago)軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜈蚣草組織中As的微區(qū)分布特征

圖1為采用同步輻射微區(qū)掃描蜈蚣草不同組織橫截面砷的原位熒光信號分布，白色表示As信號強而含量高，黑色代表As元素?zé)晒庑盘柸醵植忌佟Ｓ蓤D1可以看出，不同形態(tài)的無機砷處理對蜈蚣草各組織部位中砷元素的微區(qū)分布基本無影響，但各組織部位間砷的微區(qū)分布存在組織特異性。在根部，As主要集中分布于與根表皮緊鄰的皮層組織和維管組織(如維管柱和維管柱鞘)，且表現(xiàn)出類似帶狀分布特征(圖1B-根和C-根)；與根部類似，蜈蚣草莖部的As同樣集中于維管柱和皮層組織，并以近軸面皮層細(xì)胞中的砷含量最高，莖表皮和遠(yuǎn)軸面等組織中As含量低(圖1B-莖和C-莖)。這一現(xiàn)象與As在蜈蚣草體內(nèi)主要通過維管束組織和木質(zhì)部進(jìn)行向頂運輸?shù)霓D(zhuǎn)運機制相一致[20-21]。在羽葉部位，砷信號主要分布于羽葉葉緣部位，特別是生長有孢子囊的葉緣部位具有很強的As信號(圖1B-葉)，近葉脈端葉肉組織則As信號較弱，表明葉肉組織是砷在羽葉中的主要富集部位，與陳同斌等測定的羽葉砷濃度分布規(guī)律保持一致[22]。另一方面，由于蜈蚣草羽葉液泡對砷具有明顯的區(qū)隔化作用[8，23]，且羽葉不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)砷濃度分布存在巨大差異化(液泡?細(xì)胞壁>細(xì)胞器)[22]，進(jìn)而導(dǎo)致羽葉橫截面砷信號分布呈現(xiàn)巨大化差異。

圖1 蜈蚣草各組織中As分布的μ-SRXRF圖Fig.1 μ-SRXRF images of As distribution in different parts of P.vittata L.

2.2 植物必需營養(yǎng)元素在蜈蚣草中的分布

圖2為不同砷處理條件下蜈蚣草各組織部位橫切面7種營養(yǎng)元素分布圖，其中白色表示部位熒光信號強，元素分布含量高；黑色代表元素?zé)晒庵等?，分布少。在兩種無機砷處理下，蜈蚣草各組織部位營養(yǎng)元素的分布差異較大。添加三價砷時，大量營養(yǎng)元素Ca、P和S在蜈蚣草各組織部位橫切面整體分布相對均勻，僅莖部維管組織部位存在較為明顯的高含量分布點。而五價砷處理時，大量營養(yǎng)元素Ca、P和S在蜈蚣草各組織橫切面均存在明顯的分布高點，如羽葉葉脈、莖皮層組織、根部皮層組織及維管組織等部位都可觀察到高濃度的Ca、P和S富集(圖2)。已有研究發(fā)現(xiàn)，水培條件下，蜈蚣草對亞砷酸鹽的吸收速率遠(yuǎn)低于砷酸鹽[24]，且As(Ⅲ)相較于As(Ⅴ)又更易于排出細(xì)胞外[25]。另外，蜈蚣草在砷脅迫下可以通過調(diào)節(jié)磷、鈣的亞細(xì)胞分布來提高其耐砷毒的能力[26]。因此，可以推斷砷脅迫下，蜈蚣草組織中Ca、P和S的高含量分布有助于提高蜈蚣草的耐砷毒能力，保護植株正常生命活動。

圖2 砷處理條件下蜈蚣草組織中營養(yǎng)元素分布圖Fig.2 Nutrition elements distribution characteristics in tissues of P.vittata L.under arsenic treatments

與大量營養(yǎng)元素Ca、P和S不同，Cu和Zn作為植物生長的微量必須營養(yǎng)元素，是植物中多種氧化還原酶的組成部分或活化劑[27]。由圖2可知，兩種形態(tài)砷處理蜈蚣草各組織中均有明顯的Cu和Zn分布，但其具體分布特征受砷形態(tài)影響較大。當(dāng)外源砷為三價砷時，Cu和Zn在蜈蚣草羽葉中部區(qū)域和根部維管組織部位存在非常明顯的高濃度分布區(qū)，莖部則主要在緊鄰表皮的區(qū)域存在一個高點。而添加五價砷時，Cu和Zn在羽葉中部和葉脈部位都存在高濃度的富集，在莖部則集中分布于近軸面組織部位而遠(yuǎn)軸面端分布較少，根部則從中間的維管柱到根皮層組織均有高含量分布點并呈現(xiàn)出帶狀分布規(guī)律。此外，Zn在葉緣端的孢子囊部位有非常明顯的分布高點，而Cu沒有這一現(xiàn)象，這可能與Zn和As在蜈蚣草體內(nèi)的運輸過程存在一定程度的相似性有關(guān)[14]。

Fe、Mn作為植物體內(nèi)移動能力較弱的元素，不同形態(tài)砷處理下，蜈蚣草各組織部位中的Fe和Mn分布無明顯差異(圖2)。對于羽葉而言，F(xiàn)e、Mn多集中于葉中脈而葉緣葉肉組織含量較低；在莖橫切面上，F(xiàn)e和Mn信號均較弱，且無明顯的分布高點；根部則重點分布于表皮皮層組織和維管組織中，且以表皮皮層信號更為強烈。

2.3 As與營養(yǎng)元素分布的相關(guān)性分析

通過元素?zé)晒庑盘枏姸鹊南嚓P(guān)性分析，有助于探究蜈蚣草各組織部位As與營養(yǎng)元素分布之間的相關(guān)關(guān)系及交互作用。由表1可知，兩種無機砷處理下，As和其他7種營養(yǎng)元素在蜈蚣草各組織部位中的微區(qū)分布均存在顯著正相關(guān)性。陳同斌等[28]對砷超富集植物大葉井口邊草各組織中砷和營養(yǎng)元素的微區(qū)分布研究發(fā)現(xiàn)，大葉井口邊草羽葉和莖(葉柄)中As和營養(yǎng)元素間的微區(qū)分布同樣存在顯著或極顯著的正相關(guān)，與本研究結(jié)果保持一致。這些結(jié)果表明，As和營養(yǎng)元素在砷超富集植物中的轉(zhuǎn)運過程可能存在協(xié)同作用。

表1 不同砷處理條件下蜈蚣草各組織中As與其他營養(yǎng)元素的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

不同形態(tài)無機砷處理對蜈蚣草各組織部位中砷元素的微區(qū)分布無影響，其中蜈蚣草根莖組織中砷的微區(qū)分布主要集中于皮層組織和維管組織，羽葉中砷的微區(qū)分布則主要位于葉緣葉肉組織。植物營養(yǎng)元素在蜈蚣草各組織部位中的微區(qū)分布受砷形態(tài)影響較大，但各組織中As的微區(qū)分布與P、S、Ca、Cu、Zn、Fe和Mn等元素分布規(guī)律相似，均存在顯著正相關(guān)性。