高、低溫催青誘導(dǎo)家蠶滯育發(fā)生中的蛋白質(zhì)修飾

宋宇航，白 旭，馮嘉偉，尹延萍，肖 陽(yáng)，楊婉瑩，鐘仰進(jìn)

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣東 廣州 510640)

昆蟲(chóng)滯育(Diapause)是指昆蟲(chóng)在感受到環(huán)境的不良信號(hào)后，生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)入停滯的狀態(tài)。滯育不僅能幫助昆蟲(chóng)躲避不良環(huán)境，還能使其發(fā)育整齊，增加繁殖幾率，保證種群繁衍[1]。不同昆蟲(chóng)滯育發(fā)生的階段不同，可分為卵滯育、幼蟲(chóng)滯育、蛹滯育以及成蟲(chóng)滯育[2]。

二化性家蠶Bombyx mori是典型的卵滯育昆蟲(chóng)，由滯育激素 (Diapause hormone,DH)調(diào)控。DH 由蛹至成蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中咽下神經(jīng)節(jié)(Suboesophageal ganglion,SG)的 12 個(gè)神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)合成。成熟的DH 只有 24 個(gè)氨基酸，這個(gè)小分子多肽由心側(cè)體至咽側(cè)體釋放到血淋巴[3-5]，繼而被血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)到雌性蠶蛹的卵巢，與卵巢上的 DH 受體(Diapause hormone receptor,DHR)結(jié)合，使第二信使鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(cAMP)活性下降[6]，導(dǎo)致血淋巴中大量海藻糖被分解成葡萄糖，形成糖原。糖原被分解后合成山梨醇、甘油等有機(jī)物。家蠶產(chǎn)卵，并以蠶卵狀態(tài)進(jìn)入滯育期[7-9]。

親代經(jīng)歷的熱應(yīng)激反應(yīng)可以通過(guò)表觀遺傳效應(yīng)跨代遺傳給下一代[18]。表觀遺傳是指在基因DNA 序列沒(méi)有改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，這種變化在細(xì)胞分裂甚至隔代遺傳中保持穩(wěn)定。已知的表觀遺傳現(xiàn)象有DNA 甲基化、組蛋白修飾、基因組印記、非RNA編碼等和母體效應(yīng)等[19]。家蠶滯育誘導(dǎo)受母體效應(yīng)機(jī)制調(diào)控，為了探討表觀遺傳修飾在家蠶滯育誘導(dǎo)發(fā)生中的作用機(jī)制，我們篩選了受溫度調(diào)控滯育發(fā)生的二化性家蠶品種，將蠶卵分別放置在25和15 ℃催青，收集不同積溫點(diǎn)的蠶卵，抽提蛋白，進(jìn)行甲基化、磷酸化、乙?；瓤贵w的Western blot檢測(cè)。研究蛋白質(zhì)修飾在家蠶滯育誘導(dǎo)中的作用，研究結(jié)果將為家蠶的滯育分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 家蠶飼養(yǎng)

供試家蠶二化性品種：P50由中國(guó)科學(xué)院蠶業(yè)研究所徐安英研究員提供，大造(Dazao)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。將其蠶卵分別放在25和15℃催青孵化后，幼蟲(chóng)期置于26～28℃、相對(duì)濕度 60%±5%、12 h日夜交替的環(huán)境下用新鮮桑葉飼喂至上蔟。出蛾交配6 h后產(chǎn)卵。然后將這些蠶卵置于25℃氣候箱，10 d后觀察蠶卵滯育狀況，統(tǒng)計(jì)滯育卵、混合卵和非滯育卵的卵圈數(shù)量。

1.2 試劑

甲基化賴(lài)氨酸泛抗體、乙酰化賴(lài)氨酸泛抗體、磷酸化賴(lài)氨酸泛抗體、泛素化泛抗體、丙二酰化賴(lài)氨酸泛抗體和琥珀?；?lài)氨酸泛抗體購(gòu)自杭州景杰生物科技有限公司；SDS、BSA、Tris、二乙醇胺、尿素等購(gòu)自廣州翔博生物科技有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PR-619、TSA和NAM購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司。

1.3 蠶卵的浸酸處理

將二化性家蠶品種P50的蠶卵放在25 ℃氣候箱中催青，飼喂1代后產(chǎn)下滯育卵。將滯育卵在產(chǎn)卵 20 h 后進(jìn)行浸酸處理，在 1.075 g/L (46.1 ℃)的鹽酸溶液中浸泡4.5 min，隨即放在流動(dòng)的水中浸泡30 min，沖洗干凈后放置在25 ℃晾干。隨后將解除滯育的蠶卵分成2組，一組置于25 ℃氣候箱中明催青(高溫滯育誘導(dǎo)組)，另一組置于15 ℃氣候箱中暗催青(低溫非滯育誘導(dǎo)組)。高溫滯育誘導(dǎo)組分別在25 ℃催青后的第4、5、6和8天(點(diǎn)青期)取樣；低溫非滯育誘導(dǎo)組分別在與滯育誘導(dǎo)組相同積溫處取樣。將蠶卵樣品放于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蠶卵蛋白質(zhì)的抽提

將“1.3”中取樣的蠶卵樣品，各組稱(chēng)取同等質(zhì)量放至液氮預(yù)冷的研缽中，加液氮充分研磨成粉末。各組樣品分別加入4倍體積的酚抽提緩沖液[含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的蛋白酶抑制劑和1%的磷酸酶抑制劑、50 μmol/L PR-619、3 μmol/L 曲古柳菌素 (TSA)和 50 mmol/L 煙酰胺 (NAM)]，超聲裂解。加入等體積的 Tris平衡酚，4 ℃、6 000 r/min離心 10 min，取適量上清液，加入 5 倍體積含 0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液沉淀過(guò)夜。蛋白沉淀分別用甲醇和丙酮進(jìn)行洗滌，最后沉淀用8 mol/L尿素復(fù)溶。

1.5 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

取蠶卵蛋白，使用 BCA 試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，方法如下：將 0、5、10、15、20 μL 標(biāo)準(zhǔn)品加到酶標(biāo)條的樣品孔中，加樣品稀釋液補(bǔ)足至 20 μL，各檢測(cè) 3 個(gè)復(fù)孔；同時(shí)將 5 μL 待測(cè)蛋白樣品加到酶標(biāo)條的樣品孔中，加樣品稀釋液補(bǔ)足至 20 μL，各檢測(cè) 3個(gè)復(fù)孔；在孔里加入 200 μL BCA 工作液，37 ℃ 條件下靜置反應(yīng) 30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定D570nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.6 SDS-PAGE電泳檢測(cè)

蛋白膠由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的蛋白分離膠和5%的蛋白濃縮膠組成。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定結(jié)果，每個(gè)樣品取等量蛋白到離心管中，加入5 μL 4×Loading buffer，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 的 SDS 溶液使終體積為20 μL；依次在蛋白膠膠孔上樣1 μL預(yù)染蛋白Marker 和20 μL蛋白樣品。濃縮膠在15 mA電流下電泳15 min，將蛋白濃縮為1條線。分離膠 35 mA 電流下電泳至 Loading buffer到膠底部。膠取出后放在考馬斯亮藍(lán)R-250 染液中室溫染色2 h，然后加入脫色液，脫色至背景無(wú)色、條帶清晰。

1.7 蛋白質(zhì)修飾的Western blot檢測(cè)

取 30 μg 蛋白質(zhì)樣品，加入 4×Sample buffer，調(diào)至 1×，樣品配制質(zhì)量濃度控制在 2 g/L，95 ℃ 加熱10 min。依次在蛋白膠膠孔上樣1 μL預(yù)染蛋白 Marker 和 20 μg 蛋白樣品，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，先 80 V 恒壓 30 min，再 120 V 恒壓電泳至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠。將膠平鋪于經(jīng)轉(zhuǎn)膜液浸泡的NC膜上，隨后將轉(zhuǎn)印夾按正確電極方向放入電轉(zhuǎn)槽。4 ℃、80 V 恒壓電轉(zhuǎn) 2 h。再用含 5%(ω)脫脂奶粉的TBST溶液進(jìn)行封閉，室溫封閉1 h。封閉結(jié)束，使用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。再使用含5%(ω)脫脂奶粉的TBST溶液稀釋抗體，加入抗體后置于4 ℃冰箱，溫和搖晃孵育過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后，使用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。加入二抗，室溫孵育 1 h。二抗孵育結(jié)束，用TBST溶液 漂洗3次，每次10 min。加入熒光底物孵育5 min，用自封袋覆蓋在膜上，放入暗盒曝光。

（一）加強(qiáng)基層黨組織建設(shè)。為了充分發(fā)揮黨組織的核心作用和基層黨組織戰(zhàn)斗堡壘作用，市農(nóng)場(chǎng)管理局黨組印發(fā)了《關(guān)于認(rèn)真抓好“支部主題黨日”活動(dòng)的通知》，明確了“五個(gè)堅(jiān)持”（即堅(jiān)持領(lǐng)導(dǎo)帶頭、堅(jiān)持“全覆蓋”、堅(jiān)持依規(guī)管理、堅(jiān)持問(wèn)題導(dǎo)向、堅(jiān)持分類(lèi)指導(dǎo)），為推動(dòng)農(nóng)墾改革，保證和監(jiān)督各項(xiàng)政策的貫徹落實(shí)提供堅(jiān)強(qiáng)的組織保障。

2 結(jié)果與分析

2.1 二化性家蠶滯育性統(tǒng)計(jì)

為了篩選穩(wěn)定的受溫度調(diào)控的二化性家蠶品種進(jìn)行滯育研究，我們分別統(tǒng)計(jì)了大造和P50蠶卵在25和15 ℃催青孵化后的子代滯育情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示。25 ℃催青孵化的大造產(chǎn)下的滯育卵圈占42.9%，混合卵圈占7.1%，非滯育卵圈占50.0%；15 ℃催青孵化的大造產(chǎn)下的滯育卵圈占32.1%，混合卵圈占7.1%，非滯育卵圈占60.8%，說(shuō)明大造的滯育不完全受溫度調(diào)控。25 ℃催青孵化的P50可以產(chǎn)下100.0%滯育卵，15 ℃催青孵化時(shí)產(chǎn)下100.0%非滯育卵。后續(xù)分別在夏秋季繼續(xù)養(yǎng)蠶重復(fù)該試驗(yàn)，二化性家蠶P50的卵滯育表型可以穩(wěn)定地受溫度調(diào)控，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇使用P50進(jìn)行。滯育的3種類(lèi)型如圖2所示。

圖1 不同品種家蠶高、低溫催青后代滯育型統(tǒng)計(jì)Fig.1 The statistics of diapause type of offspring of different Bombyx mori varieties incubated at high or low temperature

圖2 3種家蠶蠶卵類(lèi)型圖片F(xiàn)ig.2 Pictures of three types of Bombyx mori eggs

2.2 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果

Sato等[20]通過(guò)溫度交換試驗(yàn)確定了二化性家蠶Kosetsu在25 ℃催青的敏感期為第3.5～5.5 天，昆蟲(chóng)的滯育誘導(dǎo)是在敏感期完成的，15 ℃催青的敏感期在第12～20 天。我們?cè)谇捌陲曫B(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)P50在15 ℃催青時(shí)發(fā)育比Kosetsu略快，因此選取了25 ℃催青4、5、6和8 d點(diǎn)青期的蠶卵蛋白作為樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出這4個(gè)取樣點(diǎn)的積溫分別為 66.8、82.0、100.2、133.6 ℃。15 ℃ 催青組分別按相同積溫進(jìn)行取樣。抽提蛋白后，取5 μL蛋白樣品，通過(guò)BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算獲得每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和蛋白質(zhì)質(zhì)量，結(jié)果如表1所示。

表1 高、低溫催青家蠶蠶卵的蛋白含量Table 1 Protein content of Bombyx mori eggs incubated at high or low temperature

2.3 蠶卵蛋白的SDS-PAGE電泳檢測(cè)

通過(guò)SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色檢測(cè)抽提蛋白質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出抽提的蛋白電泳條帶清晰、均一，蛋白無(wú)降解，組內(nèi)各泳道平行性好，可以用于后續(xù)的蛋白質(zhì)修飾檢測(cè)試驗(yàn)。同時(shí)電泳結(jié)果也顯示，在胚胎發(fā)育前期，積溫分別為66.8和82.0 ℃時(shí)，25和15 ℃催青組的蠶卵蛋白電泳條帶相似；積溫在100.2 ℃時(shí)，高、低溫處理組出現(xiàn)差異條帶。在蠶卵孵化前的點(diǎn)青期，蛋白條帶與發(fā)育前期明顯不同，說(shuō)明這個(gè)時(shí)期的胚胎發(fā)生了急劇的生理生化改變，蛋白質(zhì)代謝加速。

圖3 高、低溫催青的不同積溫蠶卵蛋白的 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE detection of protein in Bombyx mori eggs with different accumulated temperature incubated at high or low temperature

2.4 高、低溫催青P50蠶卵的蛋白修飾檢測(cè)

將上述高、低溫催青孵化的蠶卵蛋白定量，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別用甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、丙二酰化和琥珀?；贵w進(jìn)行Western blot雜交，相同曝光時(shí)長(zhǎng)下檢測(cè)高、低溫催青蠶卵蛋白質(zhì)的蛋白修飾差異，同時(shí)對(duì)各種蛋白質(zhì)修飾水平進(jìn)行掃描定量。

家蠶胚胎期蛋白質(zhì)的甲基化修飾水平在發(fā)育前期 4、5、6 d (積溫分別為 66.8、82.0、100.2 ℃)時(shí)非常低，到8 d點(diǎn)青期(積溫為133.6 ℃)時(shí)突然增高，對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描比較發(fā)現(xiàn)，25 ℃高溫組的甲基化修飾水平一直高于相同積溫下的15 ℃低溫組，但只有在點(diǎn)青期時(shí)，2組處理之間有顯著差異(圖4A、5A)。

圖4 高、低溫催青的不同積溫家蠶蠶卵的蛋白修飾檢測(cè)Fig.4 Detection of protein modification of Bombyx mori eggs with different accumulated temperature incubated at high or low temperature

對(duì)蛋白質(zhì)乙酰化修飾研究最多的是對(duì)組蛋白的修飾，我們的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)25 ℃催青組蠶卵的乙酰化修飾水平在積溫為66.8 ℃時(shí)低于15 ℃催青組蠶卵，積溫為 82.0、100.2 ℃時(shí)稍高于15 ℃催青組，而在點(diǎn)青期(積溫為133.6 ℃)又顯著低于15 ℃催青組蠶卵，在整個(gè)發(fā)育時(shí)期2組處理之間都存在顯著差異 (圖 4B、5B)。

泛素化修飾主要參與蛋白質(zhì)降解，其修飾水平在蠶卵整個(gè)催青發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)穩(wěn)定，且25 ℃催青組蠶卵蛋白的泛素化修飾水平在積溫為66.8和100.2 ℃時(shí)極顯著低于15 ℃催青的蠶卵，在積溫為82.0 ℃時(shí)顯著低于15 ℃催青的蠶卵，在點(diǎn)青期(積溫為133.6 ℃)雖然低于15 ℃催青組，但不存在顯著性差異。分析原因可能是為應(yīng)對(duì)15 ℃低溫逆境，家蠶胚胎細(xì)胞通過(guò)降解細(xì)胞器和蛋白質(zhì)以維持基本的生存，因此泛素化修飾水平高，家蠶胚胎生長(zhǎng)發(fā)育遲緩(圖4C、5C)。

從圖4D、5D中可以看出磷酸化修飾水平在整個(gè)胚胎發(fā)育期都非常高，說(shuō)明磷酸化修飾作為一種基本修飾形式參與到生長(zhǎng)發(fā)育的生理生化反應(yīng)中。在25 ℃催青組積溫為66.8、82.0和100.2℃時(shí)，磷酸化高于15 ℃催青組，在點(diǎn)青期(積溫為133.6 ℃)低于15 ℃催青組，但比較發(fā)現(xiàn)2種處理之間不存在顯著性差異。

丙二?；揎椝皆谛Q卵胚胎期較高，但高、低溫處理組間沒(méi)有明顯差異(圖4E、5E)；琥珀?；揎椩谛Q卵胚胎期發(fā)生水平較低，但在積溫為100.2 ℃時(shí)，15 ℃催青處理組蠶卵蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量為70 000的琥珀酰化修飾明顯增多，使這一積溫處總體的琥珀酰化修飾顯著增高。點(diǎn)青期(積溫為133.6 ℃)時(shí)，2組處理之間帶型差異明顯，15 ℃催青組的蠶卵蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量為35 000處有明顯修飾(圖4F、5F)，說(shuō)明琥珀?；揎椏赡馨l(fā)生在一些特異功能蛋白上。

圖5 高、低溫催青的不同積溫家蠶蠶卵的蛋白修飾灰度掃描圖Fig.5 Gray-scale scanning image of protein modification of Bombyx mori eggs with different accumulated temperature incubated at high or low temperature

3 討論與結(jié)論

家蠶滯育誘導(dǎo)是自身在胚胎期感受到外界環(huán)境信號(hào)，經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)接收整合并調(diào)節(jié)自身內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致體內(nèi)各種生理生化特性發(fā)生變化，并決定下一代是否滯育[16,21]。這種調(diào)控屬于跨代效應(yīng)，往往通過(guò)蛋白質(zhì)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)[22-23]。我們通過(guò)Western blot檢測(cè)了25和15 ℃催青后蠶卵蛋白質(zhì)的甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、丙二?；顽牾；揎椝?，其中，甲基化、乙酰化、泛素化、琥珀?；揎椝讲町惷黠@，而磷酸化和丙二?；揎椝讲町惒幻黠@。

甲基化修飾是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)和DNA修飾形式。DNA甲基化不僅調(diào)控生物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且參與了生物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答[23-24]。近年來(lái)的研究表明DNA甲基化和組蛋白的甲基化參與昆蟲(chóng)滯育誘導(dǎo)的調(diào)控。如RNA 干擾麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1a(Dnmt1a)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3(Dnmt3)會(huì)破壞其由光周期誘導(dǎo)的滯育反應(yīng)[19]。在果蠅Drosophila3 齡幼蟲(chóng)前 3 d干擾其Dpy-30基因，會(huì)導(dǎo)致組蛋白 H3(H3K4)甲基化活性下降，且組蛋白去甲基化酶基因LSD1、Su(var)3-9的表達(dá)量顯著上調(diào)，隨后的生長(zhǎng)發(fā)育中會(huì)出現(xiàn)滯育表型[25]。Egi等[26]用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷處理家蠶幼蟲(chóng)和柞蠶Antherea pernyi滯育蛹，發(fā)現(xiàn)藥物處理對(duì)短日滯育維持和長(zhǎng)日羽化無(wú)顯著影響，說(shuō)明DNA甲基化在家蠶光周期引起的滯育中不起作用，暗示DNA甲基化并沒(méi)有參與家蠶滯育誘導(dǎo)的調(diào)控。但在我們對(duì)蛋白質(zhì)的甲基化修飾篩查發(fā)現(xiàn)，25 ℃催青處理下的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)中，蠶卵蛋白的甲基化水平始終高于15 ℃催青組，到孵化前的點(diǎn)青期則是顯著更高，說(shuō)明蛋白質(zhì)甲基化可能參與了滯育誘導(dǎo)的調(diào)控，至于是否是通過(guò)對(duì)組蛋白的甲基化修飾誘導(dǎo)滯育發(fā)生則需要進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)修飾組學(xué)進(jìn)行研究。

蛋白質(zhì)乙?；侵傅鞍踪|(zhì)在乙?；D(zhuǎn)移酶的催化下把乙?；鶊F(tuán)共價(jià)結(jié)合到底物蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上，與蛋白質(zhì)去乙?；纬煽赡嫘孕揎椷^(guò)程。組蛋白修飾具有調(diào)控基因表達(dá)、維持基因組和染色體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的作用，其中組蛋白乙?；揎棇?duì)染色體結(jié)構(gòu)的影響及轉(zhuǎn)錄調(diào)控是研究最為深入的領(lǐng)域[27]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)常通過(guò)改變體內(nèi)組蛋白修飾基因表達(dá)量的方式間接參與滯育誘導(dǎo)的調(diào)控。如地蟋蟀Allonemobius socius的組蛋白乙?；騬eptin在不同發(fā)育階段始終處于動(dòng)態(tài)變化水平，Reynolds等[28]發(fā)現(xiàn)在滯育誘導(dǎo)期reptin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著上調(diào)，滯育后則急劇下調(diào)。我們的結(jié)果表明在家蠶胚胎發(fā)育期蛋白質(zhì)乙?；揎椝娇傮w上較高，在25 ℃和15 ℃催青組的不同發(fā)育階段處于動(dòng)態(tài)變化中。在蠶卵孵化前的點(diǎn)青期，25 ℃催青組蠶卵蛋白的乙?；揎椝斤@著低于15 ℃催青組，猜測(cè)蛋白質(zhì)乙?；揎椏赡軐?duì)調(diào)節(jié)自身發(fā)育起著重要作用。接下來(lái)我們將通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步篩查發(fā)生乙?；揎棽町惖牡鞍踪|(zhì)，分析其與家蠶滯育誘導(dǎo)的關(guān)系。

蛋白質(zhì)的泛素化修飾是通過(guò)泛素-蛋白酶系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system,UPS) 介導(dǎo)參與的一種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解過(guò)程[29]。泛素化修飾主要發(fā)生在賴(lài)氨酸(Lysine，Lys)殘基上，對(duì)細(xì)胞分化、調(diào)控、生物合成、細(xì)胞凋亡和免疫應(yīng)激反應(yīng)等生理過(guò)程起著重要作用[30]。在本試驗(yàn)中25 ℃催青組的泛素化水平始終低于15 ℃催青組，說(shuō)明低溫處理對(duì)蠶卵是一種不良環(huán)境刺激，泛素化修飾始終參與了這個(gè)應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是研究最為廣泛的一種修飾方式，廣泛參與到生命活動(dòng)的各種生理過(guò)程，如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、發(fā)育與分化等[31]。在催青的前期，25 ℃處理組的磷酸化修飾水平高于15 ℃處理組，說(shuō)明25 ℃催青時(shí)細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)較15 ℃催青組的頻繁，低溫組的細(xì)胞分裂、增殖和分化等活動(dòng)變緩。

丙二?；顽牾；揎椬鳛樾卤话l(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)修飾類(lèi)型，它們的修飾都發(fā)生在Lys殘基上，通過(guò)在Lys上添加丙二酰基團(tuán)或者琥珀基團(tuán)改變蛋白質(zhì)的電荷數(shù)和構(gòu)象，從而影響其功能[32-33]。本試驗(yàn)中，高、低溫處理組之間丙二酰化修飾差異并不明顯，說(shuō)明丙二酰化修飾在滯育誘導(dǎo)過(guò)程中并沒(méi)起到關(guān)鍵作用。琥珀酰化已被證實(shí)參與脂肪酸合成和氧化、線粒體呼吸和糖酵解等多種代謝途徑[34]。本試驗(yàn)中，在6 d（積溫為 100.2℃）時(shí)，25℃ 處理組的琥珀酰化修飾水平顯著低于15 ℃處理組，而在點(diǎn)青期又顯著高于低溫組，說(shuō)明代謝途徑可能參與了滯育誘導(dǎo)的調(diào)控。

本研究通過(guò)比較高、低溫催青家蠶蠶卵的不同蛋白修飾種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)高溫 25 ℃催青蠶卵相比低溫15 ℃催青的蠶卵，其乙?；头核鼗揎椝皆谡麄€(gè)時(shí)期都存在顯著性差異，而甲基化修飾水平卻始終高于低溫 15 ℃催青的蠶卵，且點(diǎn)青期差異極顯著，這與跨代熱可塑性結(jié)果類(lèi)似，猜測(cè)組蛋白甲基化、泛素化和乙?；赡茉谄渲衅鸬搅俗饔?。未來(lái)計(jì)劃通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)這2種蛋白質(zhì)修飾的關(guān)鍵蛋白，為家蠶滯育誘導(dǎo)的分子機(jī)理解析提供參考。