廣東省鴨疫里默氏桿菌流行病學(xué)監(jiān)測及遺傳進化關(guān)系

吳彩艷，廖申權(quán)，戚南山，廖曉萍，孫阮洋，方亮星，周宇峰，李林林，孫銘飛

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642； 2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物衛(wèi)生研究所/嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站,廣東 廣州 510640)

中國是世界上水禽養(yǎng)殖第一大國，肉鴨產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%左右，養(yǎng)殖量平均每年以8%～10%的速度增加。目前水禽養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為我國解決“三農(nóng)”問題的支柱產(chǎn)業(yè)，也是現(xiàn)代畜牧業(yè)的重要組成部分。雖然水禽業(yè)發(fā)展迅速，但也存在諸多制約因素，尤其是疫病多發(fā)、頻發(fā)嚴(yán)重阻礙水禽業(yè)的健康發(fā)展。其中，由鴨疫里默氏桿菌Riemerella anatipestifer引起的鴨疫里默氏桿菌病已經(jīng)成為影響水禽業(yè)經(jīng)濟最嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率高于75%，耐過的病鴨生長發(fā)育受阻，成為僵鴨，造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。一直以來主要采用疫苗免疫與藥物治療相結(jié)合的方式防控該病，但是防控的效果并不理想。一方面，鴨疫里默氏桿菌有21個血清型且各血清型間缺乏交叉保護性，而目前市售的滅活疫苗尚未涵蓋所有流行的血清型，當(dāng)出現(xiàn)疫苗株血清型以外的鴨疫里默氏桿菌感染時，現(xiàn)有的滅活疫苗不能起到保護作用，導(dǎo)致疫苗應(yīng)用受限；另一方面，雖然鴨疫里默氏桿菌對大多數(shù)抗生素或化學(xué)合成藥物較敏感，但是由于長期連續(xù)使用或不規(guī)范使用藥物導(dǎo)致耐藥性普遍存在[2]，并且已經(jīng)成為當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)面臨的最嚴(yán)峻問題。因此，本研究擬對廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株進行血清型和耐藥性調(diào)查及遺傳進化關(guān)系研究，為開展針對性疫苗免疫預(yù)防及選用敏感藥物治療提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣本 病料于 2015—2019 年采自廣東省清遠(yuǎn)、惠州、佛山等地區(qū)鴨場，采集疑似患鴨疫里默氏桿菌病病死鴨的腦、肝臟、心臟等組織，病料樣本及分離鴨疫里默氏桿菌信息見表1，相同養(yǎng)殖場采集的樣本分離的鴨疫里默氏桿菌記為1株。

表1 采集樣本與分離鴨疫里默氏桿菌信息Table 1 Collected samples and isolation information of Riemerella anatipestifer

1.1.2 試劑與藥品 改良胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基，含5%(φ)新生牛血清；胰酶大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，含5%(φ)新生牛血清；麥康凱培養(yǎng)基按細(xì)菌學(xué)常規(guī)方法配制；革蘭染色試劑和微量生化發(fā)酵管為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA marker DL 2000 和 Premix Taq 為 TaKaRa 公司產(chǎn)品；藥物標(biāo)準(zhǔn)品-氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)、諾氟沙星 (Norfloxacin，NOR)、鹽酸四環(huán)素(Tetracycline hydrochloride，TCY)、頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、阿莫西林 (Amoxicillin，AMX)、土霉素 (Oxytetracycline，OXY)、鹽酸金霉素 (Chlortetracycline hydrochloride，CTE)、氨芐西林 (Ampicillin，AMP)、慶大霉素 (Gentamicin，GEN)、鹽酸環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride，CIP)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)、大觀霉素 (Spectinomycin，STP)、磺胺嘧啶 (Sulfadiazine，SDI)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine，SUL)和磺胺對甲氧嘧啶(Sulfametoxydiazine，SMD)為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.3 試驗動物 1 日齡商品代櫻桃谷肉鴨，大約4 000只，購自廣州郊區(qū)某鴨場，未接種任何疫苗和抗血清，飼養(yǎng)于潔凈環(huán)境中，至7～14日齡進行動物回歸試驗。

1.1.4 引物合成 引物參照文獻(xiàn) [3]合成，以 16S rRNA為擴增基因。引物 ( RA-F：5′-ACGTCATCCCACC TTCCTC-3′，RA-R：5′-GTTCAGACTAA GCGAAAG-3′ )由Invitrogen公司合成。

1.1.5 參考菌株 血清1型鴨疫里默氏桿菌參考株由廣東省農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所寄生生物學(xué)研究室保存。

1.1.6 定型血清 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 型鴨疫里默氏桿菌參考株定型血清，由廣東省農(nóng)科院動物衛(wèi)生研究所寄生生物學(xué)研究室自制。

1.1.7 質(zhì)控菌 大腸埃希菌 ATCC25922 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病原分離與鑒定 病原分離：將無菌采集的病死鴨的腦、肝臟、心臟組織，劃線接種于TSA培養(yǎng)基平板和麥康凱培養(yǎng)基平板，于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取單個可疑菌落進行純化培養(yǎng)。

革蘭染色：挑取純培養(yǎng)的單菌落進行革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特性。

生化試驗：將分離株的純培養(yǎng)物接種于微量生化發(fā)酵管中，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

PCR鑒定：以分離株的菌液為模板進行PCR擴增，PCR 反應(yīng)總體積為 20 μL：Premix Taq 10 μL、上下游引物各 1 μL、菌液 1 μL、ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，以 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃1 min 進行 30 個循環(huán)，72 ℃ 延伸 7 min；反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶大小為 325 bp。

動物致病性試驗：將168株鴨疫里默氏桿菌分離株分別接種7～14日齡試驗鴨，每株接種10只試驗鴨，同時對照組設(shè)10只試驗鴨，連續(xù)觀察14 d；接種組腿部肌肉注射鴨疫里默氏桿菌分離株活菌 1×108CFU/mL，每只注射 1 mL，對照組接種生理鹽水，每只注射1 mL。隔離飼養(yǎng)，觀察致病力，記錄試驗鴨發(fā)病及死亡情況；同時根據(jù)試驗鴨死亡和發(fā)病情況在接種后1～5 d采集3～4只試驗鴨的心臟和肝臟，分離鴨疫里默氏桿菌，并進行革蘭染色、生化試驗和PCR鑒定。

血清型鑒定：取潔凈的載玻片分別滴加30 μL參考株陽性血清，再滴加30 μL分離株菌液，充分混勻，觀察1～2 min，以出現(xiàn)清晰凝集者判為陽性，否則判為陰性。

1.2.2 最低抑菌濃度的測定 從168株鴨疫里默氏桿菌分離株中選擇48株作為代表性菌株，進行最低抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC)測定。代表性菌株選擇依據(jù)：所選菌株均來自不同的規(guī)?；唸?，每個鴨場養(yǎng)殖時間均在5年以上，每批肉鴨養(yǎng)殖規(guī)模均在20 000只以上，從韶關(guān)、河源、清遠(yuǎn)、佛山、茂名、惠州、汕頭、湛江的規(guī)?；唸鲭S機各選5株，從云浮和肇慶的規(guī)?；唸鲭S機各選4株，總計48株。

抗菌藥物貯存液的制備：將藥物制成2 560 mg/L的原液，抗菌藥物貯存液按照梯度稀釋。

抗菌藥物濃度范圍：根據(jù)抗菌藥物敏感性試驗操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點值，特殊情況除外。

接種物的制備：采用直接菌落懸液配制法，將培養(yǎng)18～24 h的鴨疫里默氏桿菌菌落調(diào)配成0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的懸液，再以TSB培養(yǎng)基按體積比1∶100稀釋后備用；在15 min內(nèi)接種完配制好的接種物，并取1份接種物在TSA平板上培養(yǎng)，以檢查接種物的純度。

抗菌藥物稀釋及菌液接種：以改良的試管兩倍稀釋法[4]測定鴨疫里默氏桿菌分離株的MIC，取14支滅菌試管為一排，除第1管加入1.6 mL TSB培養(yǎng)基外，其余每支試管均加入1 mL TSB培養(yǎng)基，于第1管中添加0.4 mL待測藥物原液并混勻，吸取1 mL加入第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第12管，混勻后吸取1 mL棄掉，第13管為不加藥物的陽性對照，第14管為不加藥物和菌液、只加生理鹽水的陰性對照；向第1～13管中各加入1 mL稀釋菌液，此時第1～12 管藥物終質(zhì)量濃度分別為 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/L。

培養(yǎng)：將接種后的試管置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)22～24 h。

結(jié)果判斷：在陽性對照和陰性對照成立且質(zhì)控菌株的MIC處于質(zhì)控范圍的情況下，肉眼可見澄清的最低藥物濃度管即為測試菌株的MIC。

藥物敏感性判定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[4-5]判斷藥物耐藥、敏感和中介。

1.2.3 全基因組序列特征分析與核心基因組進化樹的構(gòu)建 基因組DNA文庫的構(gòu)建與序列測定：使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照操作說明，提取鴨疫里默氏桿菌分離株的基因組DNA；通過濃度測定和瓊脂糖凝膠電泳，初步質(zhì)檢合格后，構(gòu)建Illumina(250 bp)文庫，利用Illumina Novaseq 6000 平臺進行測序，下機數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和去除接頭后運用SPAdes v3.6.2對原始數(shù)據(jù)進行拼接[6]，拼接后的數(shù)據(jù)使用Quast軟件進行質(zhì)控[7]。

序列特征分析。耐藥基因分析：將拼接好的測序結(jié)果上傳至CGE的ResFinder4.1數(shù)據(jù)庫[8]以分析菌株所攜帶的耐藥基因(ARGs)(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)；ST分型：將拼接好的測序結(jié)果上傳至多位點序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)數(shù)據(jù)庫以分析菌株所屬的ST型(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)。

構(gòu)建核心基因組進化樹：從NCBI Genome下載數(shù)據(jù)庫中全部共計59株鴨疫里默氏桿菌的全基因組序列，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 11845(NCBI登錄號：GCA_000252855.1)作為參考菌株，利用Parsnp軟件比對全基因組序列并構(gòu)建核心基因組進化樹[9]，使用hierBAPS軟件進行進化樹分簇[10]，再利用FigTree v1.4.2和iTOL v4軟件進行美化注釋[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨疫里默氏桿菌分離與鑒定

分離株在TSA平板上長成光滑、濕潤、半透明的奶油狀菌落，在麥康凱平板上不生長；革蘭染色呈陰性的單個或成雙排列的短小桿菌；生化試驗顯示分離株均不發(fā)酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇，不產(chǎn)生硫化氫，不利用檸檬酸鹽，甲基紅試驗、靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原試驗陰性，氧化酶、過氧化物酶試驗陽性；通過特異性PCR擴增，分離株均可擴增到約300 bp的條帶，與目的條帶大小一致(圖1)。

圖1 鴨疫里默氏桿菌分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of Riemerella anatipestifer isolates

2.2 動物回歸試驗

所有鴨疫里默氏桿菌分離株對試驗鴨均有不同程度的致病力，發(fā)病率達(dá)100%，致死率介于70%～100%，其中70.24%(118/168)的分離株的毒力較強，在接種后48 h內(nèi)試驗鴨全部死亡，剖檢未見典型的鴨疫里默氏桿菌病病理變化，其余分離株接種試驗鴨后病程較長，剖檢可見典型的鴨疫里默氏桿菌病病理變化。所有試驗鴨接種分離株后均表現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌病臨床癥狀，主要表現(xiàn)精神沉郁，采食、飲水減少或廢絕，排綠色或黃綠色糞便，共濟失調(diào)，頭頸震顫，角弓反張及轉(zhuǎn)圈運動等，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。從接種鴨疫里默氏桿菌分離株試驗鴨的肝臟或心臟中均可分離到接種菌，革蘭染色均為陰性的短小桿菌，生化試驗結(jié)果符合鴨疫里默氏桿菌特性，PCR鑒定結(jié)果與分離株初次分離鑒定結(jié)果一致。因此，根據(jù)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果和動物回歸試驗結(jié)果確定從廣東地區(qū)的鴨場共分離到168株鴨疫里默氏桿菌菌株。

2.3 血清型鑒定

鴨疫里默氏桿菌分離株血清型鑒定結(jié)果見表2，血清 1、2、3、5、6、7、8、10 型和未定型均有流行，其中高達(dá)54.17%(91/168)的分離株為1型，其次為2型，占27.97%(47/168)。因此，廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株以1型為優(yōu)勢血清型。

表2 各地區(qū)各血清型鴨疫里默氏桿菌分離株數(shù)量Table 2 Isolate number of each serotype for Riemerella anatipestifer isolates from different districts

2.4 藥物敏感性試驗

藥物對鴨疫里默氏桿菌代表性菌株的MIC測定結(jié)果及敏感性統(tǒng)計結(jié)果見表3。根據(jù)MIC分析各藥物抑制50%和90%鴨疫里默氏桿菌菌株生長的MIC，即 MIC50和 MIC90，MIC50介于 0.25～＞256 mg/L，其中，頭孢噻肟最低，僅 0.25 mg/L，阿莫西林為 1 mg/L，氨芐西林、土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、氧氟沙星均為 8 mg/L，鹽酸環(huán)丙沙星為 16 mg/L，諾氟沙星、大觀霉素、慶大霉素分別為 32、64、128 mg/L，磺胺嘧啶為256 mg/L，卡那霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶均為＞256 mg/L；MIC90值介于 8～＞256 mg/L，其中，頭孢噻肟最低，僅8 mg/L；土霉素和鹽酸金霉素為16 mg/L；鹽酸四環(huán)素、氧氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星均為 32 mg/L；諾氟沙星為 64 mg/L；阿莫西林、氨芐西林、大觀霉素均為128 mg/L；卡那霉素、慶大霉素、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶較高，均為＞256 mg/L。

表3 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株最低抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果1)Table 3 The minimum inhibitory concentration (MIC) of 48 representative isolates of Riemerella anatipestifer

分析鴨疫里默氏桿菌代表性菌株對受試藥物的敏感性，對慶大霉素的耐藥率高達(dá)91.67%(44/48)；對卡那霉素和鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥率分別為89.58%(43/48)和81.25%(39/48)；對土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶的耐藥率介于60%～80%；對磺胺嘧啶和氨芐西林的耐藥率介于30%～60%；對阿莫西林、頭孢噻肟和大觀霉素的耐藥水平較低(30%以下)。

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，分析鴨疫里默氏桿菌代表性菌株的多重耐藥性，結(jié)果如圖2所示。48株鴨疫里默氏桿菌對5～12種藥物耐藥，其中9耐和10耐的菌株總數(shù)最多，占54.17%(26/48)，6耐和11耐、7耐與8耐的菌株數(shù)相同，分別為4株和5株，而5耐和12耐菌株數(shù)最少，各有2株。

圖2 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株多重耐藥性分布Fig.2 Results of multi-drug resistance of 48 Riemerellaanatipestifer representative isolates

統(tǒng)計并分析鴨疫里默氏桿菌分離株的耐藥譜，48株鴨疫里默氏桿菌具有44種耐藥譜型，其中40株為單一譜型，構(gòu)成比為2.08%(1/48)，其余4種耐藥譜型分別為2株所共有，構(gòu)成比為4.16%(2/48) (表4)。

表4 48株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株耐藥譜統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Drug resistance spectrum of 48 representative isolates of Riemerella anatipestifer

2.5 全基因組測序分析

由北京諾禾致源科技股份有限公司對48株鴨疫里默氏桿菌代表性菌株進行全基因組測序，經(jīng)過Quast軟件質(zhì)檢后，其中2株拼接質(zhì)量不高，故僅有46株進行后續(xù)分析。共檢出6種耐藥基因，其中攜帶四環(huán)素類耐藥基因tet(X)的菌株最多，陽性率高達(dá)82.60%(38/46)；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(F)陽性率為73.91%(34/46)，而大環(huán)內(nèi)酯類另一耐藥基因ere(D)的陽性率僅有19.57%(9/46)；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaOXA-209的陽性率為 54.35%(25/46)；氨基糖苷類耐藥基因aadS和氟苯尼考耐藥基因floR的陽性率相對較低，分別為34.78%(16/46)和30.43%(14/46)。耐藥基因結(jié)果見表5。

表5 46株鴨疫里默氏桿菌代表性分離株耐藥基因攜帶情況Table 5 The resistance genes carried by 46 Riemerellaanatipestifer representative isolates

基于獲得的46株鴨疫里默氏桿菌全基因組序列，進一步分析其MLST，其中18株ST分型成功，分別為 ST38(4 株)、ST13(2 株)、ST24(2 株)、ST35(2株)、ST44(2株)，其他ST型分別為ST2、ST16、ST21、ST34、ST42 和 ST43，均只有 1 株，其余28株為未知ST型；說明本研究測序菌株的ST型呈多樣性，未出現(xiàn)優(yōu)勢ST型。

將本研究46株鴨疫里默氏桿菌菌株的全基因組測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中59株鴨疫里默氏桿菌菌株的全基因組數(shù)據(jù)進行比對，構(gòu)建核心基因組進化樹(圖3)，數(shù)據(jù)庫59株鴨疫里默氏桿菌菌株中，39株來源于中國，9株來源于英國，2株來源于印度，德國、俄羅斯和美國各有1株，另有6株未標(biāo)注來源?？傆?05株鴨疫里默氏桿菌菌株分布在6個分簇群系中，本研究所有測序菌株與數(shù)據(jù)庫中來自中國的菌株相似度較高，且集中分布在3個簇群中，其中Clade 1群系最大，包含67株，我國菌株占50.75%(34/67)，其次為 Clade 3 群系，包含 17 株，我國菌株占 47.06%(8/17)，Clade 2 群系包含 5 株鴨疫里默氏桿菌，我國菌株數(shù)占60.00%(3/5)。數(shù)據(jù)庫中大部分鴨疫里默氏桿菌菌株來自于中國，而歐洲來源的菌株占比較低，并且觀察到來自世界各地的鴨疫里默氏桿菌菌株間存在地理分布差異。另外，數(shù)據(jù)庫中我國菌株從1990年到2017年間均有收集，持續(xù)時間接近30年，時間跨度較大，但仍能與本研究測序菌株在進化樹中聚集在一起，說明在我國鴨疫里默氏桿菌存在區(qū)域內(nèi)長時間持續(xù)傳播的特點。

圖3 105株鴨疫里默氏桿菌菌株核心基因組系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of core genomes for 105 isolates of Riemerella anatipestifer

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

鴨疫里默氏桿菌病血清型復(fù)雜，在世界范圍內(nèi)流行，目前在國內(nèi)多個地區(qū)均有鴨疫里默氏桿菌血清型流行情況的報道，廣西百色分離株血清型比較單一，全部為1型[12]；山東分離株至少存在1、2、6、10和11型5種血清型，其中以1型和2型為優(yōu)勢血清型[13-14]；超過半數(shù)的江蘇分離株為1型[15]；安徽分離株則多達(dá)7種血清型，但以1型和2型發(fā)生最廣泛[16]；河南分離株以1型和2型多發(fā)，此外還流行 10 型和未定型[17]；血清 1、2、3、4、8、10、15 型在廣東地區(qū)均有流行，以1型最多發(fā)[18-20]。與國內(nèi)情況類似，國外也流行多種血清型，美國以1型為主，此外還流行 1、2、5、11、13、15、19、21 型[21]；1型和2型為英國多發(fā)血清型，同時5、9、13和15 型也有流行[22]；泰國主要流行 1、5、6、7、10 和21型[23]；新加坡以1、5和10型這3種血清型為主[24]；1型和3型為丹麥的優(yōu)勢血清型[25]；韓國只有1、4和7型這3種血清型[26]；澳大利亞則流行1、6、8、9、13和14型[27]。本研究高達(dá)54.17%的分離株為血清1型，也是優(yōu)勢血清型。分析國內(nèi)外鴨疫里默氏桿菌血清型流行情況發(fā)現(xiàn)多血清型流行已呈基本態(tài)勢，其中1型為最普遍發(fā)生的血清型，也是重點防控的血清型。

在養(yǎng)殖過程中，由于長期應(yīng)用抗菌藥物治療鴨疫里默氏桿菌病，導(dǎo)致廣泛而嚴(yán)重的耐藥性。調(diào)查顯示山東分離株對氨基糖苷類藥物高度耐藥，并且具有多重耐藥性[28]；安徽分離株對恩諾沙星、新霉素、安普霉素表現(xiàn)不同程度的耐藥性[29]；貴州分離株則對氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等藥物表現(xiàn)高度耐藥，多重耐藥高達(dá)17耐[30]；同樣，廣東地區(qū)分離株耐藥狀況也比較嚴(yán)峻，朱元軍等[31]報道分離株對丁胺卡那、卡那霉素、慶大霉素和鏈霉素高度耐藥，多數(shù)分離株表現(xiàn)七重以上耐藥。另外，耐藥性還具有隨藥物使用時間延長進一步加劇的現(xiàn)象，從同一地區(qū)采集的分離株對紅霉素和多黏菌素B的耐藥率呈逐年升高的趨勢[32-33]。本研究采樣養(yǎng)殖場經(jīng)常采用慶大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶、頭孢類藥物、喹諾酮類藥物、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、土霉素、多黏菌素B、林可霉素等藥物進行治療，從養(yǎng)殖場樣本中分離的鴨疫里默氏桿菌對頭孢噻肟、阿莫西林、大觀霉素的耐藥率低于30%，對土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸金霉素、慶大霉素、卡那霉素等藥物均表現(xiàn)高度耐藥。因此，總體上養(yǎng)殖場用藥與耐藥表型具有一定的對應(yīng)性，在臨床選擇藥物時，最好先進行藥敏試驗，選用抗菌效果較好的藥物，同時也要結(jié)合本養(yǎng)殖場的用藥史合理用藥。

通過分析本研究測序菌株耐藥表型與耐藥基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)攜帶tet(X)基因的菌株對四環(huán)素類藥物全部表現(xiàn)耐藥，因此，tet(X)基因是介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的最重要基因[34]；氨基糖苷類耐藥率高于耐藥基因aadS的攜帶率，說明除耐藥基因外還存在其他因素導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥，這一結(jié)果與蔡秀磊[35]研究結(jié)論一致，即氨基糖苷類耐藥還與基因盒-整合子系統(tǒng)有關(guān)；blaOXA-209的陽性率與耐藥率基本一致。由于本研究未對大環(huán)內(nèi)酯類和氟苯尼考進行藥物敏感性測試，因此，尚不清楚這2類藥物耐藥基因攜帶率與耐藥表型的相關(guān)性。總體上，耐藥表型與耐藥基因具有一定的相關(guān)性，但是也要明確鴨疫里默氏桿菌分離株產(chǎn)生耐藥性的原因比較復(fù)雜，除與耐藥基因有關(guān)外，還與環(huán)境、藥物等諸多因素有關(guān)。

通過系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，來自世界各地的鴨疫里默氏桿菌菌株間存在地理分布差異，本研究的測序菌株主要分布在Clade 1簇群，且血清型全部為1型，由于數(shù)據(jù)庫中其他菌株沒有相關(guān)血清型信息，因此，具體血清型不明確，但可以推測，該簇群的分離株與血清1型密切相關(guān)。

鑒于本研究鴨疫里默氏桿菌血清型復(fù)雜及耐藥性嚴(yán)重的現(xiàn)狀，應(yīng)首先針對當(dāng)?shù)鼗虮攫B(yǎng)殖場主要流行的血清型選取相應(yīng)的滅活疫苗進行免疫，當(dāng)出現(xiàn)疫苗株以外的血清型感染時，則以當(dāng)?shù)鼗虮攫B(yǎng)殖場的分離株制備滅活疫苗，同時選擇敏感藥物并合理用藥輔助治療，可以達(dá)到更有效的防治效果。

3.2 結(jié)論

本研究在對廣東地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株的血清型和耐藥性初步了解的基礎(chǔ)上，又結(jié)合全基因組測序數(shù)據(jù)對耐藥基因、ST分型、遺傳進化樹做進一步分析，發(fā)現(xiàn)分離株的優(yōu)勢血清型為1型，耐藥性嚴(yán)重，所攜帶的耐藥基因與耐藥表型具有一定的相關(guān)性，ST型呈多樣性，與MLST 數(shù)據(jù)庫中來自我國的菌株遺傳背景相近，研究結(jié)果為鴨疫里默氏桿菌病疫苗免疫預(yù)防與藥物治療及掌握鴨疫里默氏桿菌遺傳進化特征提供了依據(jù)。