先天性EDNRB基因缺陷對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

謝聃 宋贊民 王霞 張擁波

EDNRB基因作為一種臨床致病率表達(dá)較高的基因，不僅是腸道形成腸神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵基因，也參與并且介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖、遷移的主要過程。腦組織EDNRB基因表達(dá)上調(diào)還具有抗細(xì)胞凋亡的作用［1?2］。EDNRB基 因 主 要 表 達(dá) 于 胚 胎 的 腦 室 區(qū) 以 及腦室下區(qū)，并在嬰兒腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中繼續(xù)表達(dá)［3?5］。研 究 顯 示，EDNRB基 因 變 異 致 先 天 性 巨 結(jié)腸不僅發(fā)生于人類，亦見于其他物種如大鼠、小鼠、豬和馬，如先天性巨結(jié)腸大鼠模型攜帶EDNRB基因誘導(dǎo)的無癥狀變異［6?7］；純合子型大鼠腦組織可檢測到EDNRB基因缺陷，從而干預(yù)和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中EDNRB基因介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞增殖和凋亡［8］。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋白質(zhì)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）不僅可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，而且是誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的重要因子［9］。增強(qiáng)EDNRB基因活性可使大鼠小腦區(qū)域和尾狀核生成更多的BDNF和GDNF［10］。本研究對EDNRB基因缺陷的新生大鼠海馬組織（CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回）進(jìn)行研究，觀察EDNRB基因缺陷對純合子型（sl/sl）神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，并與野生型（+/+）、雜合子型（+/sl）相應(yīng)腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞增殖和凋亡進(jìn)行比較；同時(shí)測定3種基因型新生大鼠海馬組織BDNF和GDNF的表達(dá)量，探究EDNRB基因缺陷是否導(dǎo)致BDNF和GDNF表達(dá)變化。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動物與分組本實(shí)驗(yàn)所用動物為先天性301對堿基缺失致EDNRB基因缺陷大鼠，均為+/sl成對雄性和雌性大鼠，由澳大利亞國立大學(xué)動物中心飼養(yǎng)（許可證號：Canberra Hospital.03333574001），交配后將同一窩產(chǎn)后2~3 d新生大鼠和雌性大鼠取出（雌性大鼠喂養(yǎng)幼鼠），并根據(jù)幼鼠皮毛顏色、基因檢測結(jié)果將其分成+/+、+/sl和sl/sl共3種基因型，每組各6~8只。于室溫21~25℃、相對濕度40%~60%、12 h晝-12 h夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，本研究經(jīng)澳大利亞國立大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核批準(zhǔn)（審批號：A2012/50）。

2.試劑與儀器（1）主要藥品與試劑：蛋白酶K購自美國Promega生物公司，戊巴比妥和多聚甲醛由澳大利亞國立大學(xué)約翰科廷醫(yī)學(xué)研究中心神經(jīng)研究所實(shí)驗(yàn)室提供，磷酸鹽緩沖液（PBS）為該實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配置，BDNF和GDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒分別購自美國BioSource公司和R&D systems公司。（2）主要設(shè)備與儀器：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）循環(huán)儀購自美國Biometro T3 thermocycle公司，Gene Quant pro型紫外光分光光度計(jì)購自美國Biochrom公司，Nikon A1熒光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司，Image J軟件購自美國NIH公司。

二、研究方法

1.TUNEL染色檢測海馬組織細(xì)胞凋亡每種基因型取出生后2 d的新生大鼠各6只，腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg），開胸顯露心臟，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液灌注心臟，以50 ml注射器插入左心室、剪開右心耳，快速注入磷酸鹽緩沖液200~300 ml，經(jīng)體循環(huán)和肺循環(huán)至右心耳，直至流出清亮液體，以清除體內(nèi)血液；于顯微鏡下解剖切取腦組織，取出整個(gè)海馬組織和齒狀回，于?20℃制備層厚12 mm的冰凍切片。每只新生大鼠選取切片效果及部位最佳的5張標(biāo)本行4’，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）染色和TUNEL染色，細(xì)胞呈藍(lán)色為DAPI染色陽性，為背景細(xì)胞；細(xì)胞呈紅色或綠色為TUNEL染色，為凋亡細(xì)胞。每只新生大鼠選取切片染色效果最佳的3張標(biāo)本，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，采用Image J軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目。上述實(shí)驗(yàn)步驟均于隨機(jī)取片、基因型雙盲情況下進(jìn)行。

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定GDNF和BDNF表達(dá)量每組選取出生后2 d的新生大鼠各7~8只，切取腦組織方法同前，切片機(jī)在?80℃制備層厚12 mm的冰凍切片。每只新生大鼠取6張切片（BDNF和GDNF各3張），孵育至21~25℃，采用ELISA檢測試劑盒測定BDNF和GDNF表達(dá)量，行熒光原位雜交（FISH）染色，顯色均勻后20 min內(nèi)記錄450 nm波長處光密度（OD）值，以pg/g表示。

3.統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro?Wilk檢驗(yàn)，以P>0.05為符合正態(tài)分布；方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，以P>0.05為符合方差齊性假設(shè)。呈正態(tài)分布且符合方差齊性假設(shè)的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

熒光共聚焦顯微鏡觀察顯示，出生后2 d的+/+新生大鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回偶見凋亡細(xì)胞，CA3區(qū)凋亡細(xì)胞密度更低；sl/sl新生大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回凋亡細(xì)胞數(shù)目均多于+/+新生大鼠（圖1，2）。3種基因型新生大鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，表1），其中，sl/sl凋亡細(xì) 胞 數(shù) 目 高 于+/+（P=0.000）和+/sl（P=0.000），而+/+與+/sl組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.175，表2）。進(jìn)一步計(jì)數(shù)海馬各區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)目，CA1區(qū)最高，占凋亡細(xì)胞總數(shù)比例分別為+/+占69.41%、+/sl占64.41%和sl/sl占82.82%；其 次 為CA3區(qū)，分 別為+/+占17.84%、+/sl占24.11%和sl/sl占9.92%；以齒狀回最低，分別為+/+占12.83%、+/sl占11.64%和sl/sl占7.31%。表明EDNRB基因在幼鼠海馬結(jié)構(gòu)發(fā)育過程中具有抗凋亡作用。

圖1 出生后2 d的+/+和sl/sl新生大鼠海馬組織DAPI和TUNEL染色圖低倍放大Figure 1 DAPI and TUNEL staining images of hippocampal tissues of+/+and sl/sl genotypes rats 2 d postnatal.low power magnified

表1 3種基因型新生大鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)目的比較（±s，/mm2）Table 1.Comparison of TUNEL positive cell density in rats of 3 genotypes(±s,/mm2)

表1 3種基因型新生大鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)目的比較（±s，/mm2）Table 1.Comparison of TUNEL positive cell density in rats of 3 genotypes(±s,/mm2)

組別+/+組sl/sl組+/sl組只數(shù)6 6 6 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目11.30±4.90 35.20±7.10 16.20±6.60 F值24.315 P值0.000

表2 3種基因型新生大鼠海馬凋亡細(xì)胞數(shù)目的兩兩比較Table 2.Pairwise comparison of TUNEL positive cell density in rats of 3 genotypes

ELISA法顯示，出生后2 d的3種基因型新生大鼠海馬組織BDNF（P=0.479）和GDNF（P=0.107）表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EDNRB基因缺陷不影響新生大鼠海馬BDNF和GDNF的表達(dá)（表3）。

表3 3種基因型新生大鼠海馬BDNF和GDNF表達(dá)量的比較（±s，pg/g）Table 3.Comparison of the hippocampus concentrations of BDNF and GDNF in rats of 3 genotypes(±s,pg/g)

表3 3種基因型新生大鼠海馬BDNF和GDNF表達(dá)量的比較（±s，pg/g）Table 3.Comparison of the hippocampus concentrations of BDNF and GDNF in rats of 3 genotypes(±s,pg/g)

BDNF，brain?derived neurotrophic factor，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；GDNF，glial cell line?derived neurotrophic factor，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

組別+/+組sl/sl組+/sl組F值P值只數(shù)8 6 7 BDNF 99.32±22.65 101.34±17.88 87.63±25.22 0.766 0.479 GDNF 211.35±66.12 157.13±57.67 140.78±65.14 2.538 0.107

討 論

本研究檢測EDNRB基因缺陷的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF和BDNF表達(dá)變化，探討3種基因型（+/+、+/sl和sl/sl）在新生大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中對神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)因子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與+/+相比，sl/sl新生大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，但3種基因型海馬GDNF和BDNF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與神經(jīng)營養(yǎng)因子介導(dǎo)的途徑無關(guān)。

內(nèi)皮素家族具有參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞營養(yǎng)等多種功能。例如，大腦EDNRB基因激活可促進(jìn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白和多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，EDNs和EDNRB基因的作用機(jī)制是防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞和施萬細(xì)胞前體存活［11?12］。Dembowski等［13］在EDNRB基 因 缺 陷 純 合子型大鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬各區(qū)和齒狀回以及小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多；這一現(xiàn)象亦可見于其他腦區(qū)，如大腦皮質(zhì)、尾狀核和嗅球等（未發(fā)表）。因此我們推測，EDNRB基因缺陷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多涉及全腦，并非僅見于海馬、小腦等特定區(qū)域，尚待進(jìn)一步研究。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，EDNRB基因影響神經(jīng)細(xì)胞的存活和凋亡，其抗細(xì)胞凋亡作用可在EDNRB基因缺陷后逆轉(zhuǎn)，表明EDNRB基因促神經(jīng)細(xì)胞存活和抗凋亡的作用不僅貫穿胚胎大鼠神經(jīng)系統(tǒng)形成的全過程，還一直延續(xù)至大鼠出生后神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中。

圖2 熒光共聚焦顯微鏡觀察顯示，出生后2 d的sl/sl新生大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回凋亡細(xì)胞數(shù)目多于+/+TUNEL染色低倍放大Figure 2 Confocal fluorescence microscopy showed the number of TUNEL positive cells of sl/sl rats 2 d postnatal was significantly increased compared with that of+/+rats.TUNEL staining low power magnified

值得注意的是，本研究顯示，正常新生大鼠的所有腦區(qū)一直存在較低密度和頻率的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，+/+海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目平均為11個(gè)/mm2［2］，小 腦 為4個(gè)/mm2、尾 殼 核9個(gè)/mm2、嗅 球1個(gè)/mm2、大腦皮質(zhì)6個(gè)/mm2（未發(fā)表）。我們課題組的既往研究顯示，BrdU標(biāo)記的細(xì)胞核分布與TUNEL染色陽性細(xì)胞相背離，如+/+大鼠BrdU標(biāo)記的細(xì)胞密度在齒狀核最高，表明該區(qū)域細(xì)胞增殖最旺盛，但TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)目最少（占12.80%），提示該區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡處于最低水平；而CA1區(qū)與齒狀核恰好相反，BrdU標(biāo)記的細(xì)胞增殖數(shù)目最低，而TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)目最高，且這種趨勢在3種基因型中均可見［14］。EDNRB基因缺陷的純合子型先天性巨結(jié)腸大鼠特定腦區(qū)細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加，可能導(dǎo)致對應(yīng)區(qū)域腦體積縮小，遠(yuǎn)期可出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損癥狀，但是由于純合子型先天性巨結(jié)腸大鼠通常于出生1~2周后死于營養(yǎng)不良和小腸結(jié)腸炎等，目前尚無針對sl/sl成年大鼠腦結(jié)構(gòu)和功能改變的探索。宋贊民教授與澳大利亞墨爾本大學(xué)醫(yī)學(xué)院Stamp教授合作，成功制備sl/sl大鼠結(jié)腸造口模型［15］，使sl/sl大鼠存活至成年（出生后4周后處死），從而能夠進(jìn)一步觀察腦結(jié)構(gòu)和功能改變。業(yè)已證實(shí)，sl/sl大鼠存在小腦神經(jīng)細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞凋亡增加［2］，小腦主要參與調(diào)節(jié)運(yùn)動協(xié)調(diào)控制和平衡功能，海馬則在學(xué)習(xí)記憶功能中發(fā)揮重要作用，因此，成熟的腦功能損傷研究將主要圍繞上述神經(jīng)功能展開。

神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和GDNF的主要功能是支持正常神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和修復(fù)損傷神經(jīng)細(xì)胞。BDNF可以防止腦缺血后谷氨酸持續(xù)釋放引起的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，從而維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷；并可增加運(yùn)動和感覺神經(jīng)細(xì)胞軸突切斷后的存活率，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和再生，減少運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞凋亡等［16?17］。GDNF可以提高多巴胺能神經(jīng)元的存活率，抑制發(fā)育過程中運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞的程序性死亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突定向生長以及運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)和神經(jīng)再生等［18?19］。成年 大 鼠 中 樞神經(jīng) 系 統(tǒng) 表 達(dá)GDNF，主 要集中于紋狀體，其他部位則局限于多巴胺能神經(jīng)元分布腦區(qū)［20］。發(fā)生腦缺血時(shí)，海馬齒狀回GDNF mRNA水平明顯增加，提示GDNF對神經(jīng)細(xì)胞的缺血性損傷有保護(hù)作用［21］。神經(jīng)營養(yǎng)因子在抗神經(jīng)損傷方面具有重要的作用，且內(nèi)源性或外源性給予神經(jīng)營養(yǎng)因子可預(yù)防和治療神經(jīng)細(xì)胞損傷業(yè)已證實(shí)［22］。GDNF和內(nèi)皮素?3激活后予以特定標(biāo)記，可用于定位神經(jīng)細(xì)胞的遷移、分化和存活［23］。Koyama等［24?25］發(fā)現(xiàn)，BDNF和GDNF的激活及其對神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響與EDNRB基因存在相關(guān)性。動物模型顯示，成年大鼠腦室內(nèi)注射EDNRB受體激動劑，其尾狀核星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖增加［23］。EDNRB受體的激活可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)mRNA和多肽，增加GDNF的 合 成［24?26］，這 一 現(xiàn) 象 亦 可 見 于 大 鼠 海 馬 和大腦星形膠質(zhì)細(xì)胞［24］。是否EDNRB基因缺陷同樣影響sl/sl大鼠各腦區(qū)神經(jīng)生長因子的表達(dá)呢？本研究顯示，3種基因型新生大鼠海馬組織GDNF和BDNF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與我們課題組既往研究 小 腦BDNF和GDNF表達(dá) 變 化 結(jié) 果 相 一 致［2，22］。究其原因，新生大鼠出生后BDNF和GDNF水平相對較低，至出生后第2周其水平方升高，即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的成熟過程中［27?28］，可能影響本研究結(jié)果。此外，本研究和我們課題組既往研究均顯示，新生大鼠各腦區(qū)BDNF基線水平差異較大，小腦表達(dá)量較高（約500 μg/g）［2］，海馬較低（本研究為100 μg/g），大腦皮質(zhì)最低（<20 pg/g）。因此，BDNF在小腦中的差異性表達(dá)最具代表性。

綜上所述，本研究探討EDNRB基因缺陷的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF和BDNF的表達(dá)變化，與+/+相比較，EDNRB基因缺陷sl/sl新生大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)凋亡細(xì)胞顯著增加，提示EDNRB基因在神經(jīng)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，但其作用是否一直持續(xù)存在并影響成年大鼠，造成其相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損，尚待進(jìn)行成年大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

利益沖突無