育幼經(jīng)歷對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量的影響

張曉卉， 張名岳, 2*， 張萍， 黃祥明, 2， 吳孔菊, 2， 蘭景超, 2， 侯蓉, 2(. 成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都6008；2. 四川省大熊貓科學(xué)研究院，成都6008)

雖然以圈養(yǎng)為模式的大熊貓遷地保護(hù)繁育計劃基本實(shí)現(xiàn)了圈養(yǎng)大熊貓種群數(shù)量以及遺傳多樣性的自我維持(Xie，2016)，但從福利角度看其圈養(yǎng)模式存在一定弊端，如生存環(huán)境固定單一和空間狹小、育幼期過早的母子分離、飼喂時間固化以及刺激缺乏等，這些模式導(dǎo)致對大熊貓必需行為的剝奪、本能行為表達(dá)的抑制和異常行為表現(xiàn)的增加(Liu.，2003；張志和，魏輔文，2006)，影響大熊貓正常行為的充分表達(dá)。圈養(yǎng)大熊貓暴露的一些生產(chǎn)上的實(shí)際問題(如自然繁殖能力差)始終沒有得到解決(Swaisgood.，2003，2006)，嚴(yán)重影響了圈養(yǎng)大熊貓野外放歸計劃的實(shí)施，不符合科學(xué)繁育、健康飼養(yǎng)的大熊貓遷地保護(hù)國家戰(zhàn)略。造成這些問題的原因極有可能與圈養(yǎng)生活環(huán)境不能夠滿足大熊貓對各種生理需求(包括對配偶以及環(huán)境舒適度的需求)的自由選擇，擇偶和交配等自然本能行為不能夠充分表達(dá)或被抑制有關(guān)(Zhang.，2004；Martin-Wintle.，2015，2018，2020)。

育幼期是動物身體發(fā)育，包括神經(jīng)發(fā)育、肌肉骨骼發(fā)育的關(guān)鍵時期，缺乏足夠的新鮮刺激，會影響神經(jīng)發(fā)育(Hall，1998；Latham & Mason，2008)。圈養(yǎng)人工育幼環(huán)境單調(diào)、狹小以及多種非自然應(yīng)激源的干擾(游客噪音、更換獸舍以及非自然的多種氣味等)，會給育幼期母獸造成壓力，導(dǎo)致?lián)嵊鬃袝r不能為幼仔提供更多的學(xué)習(xí)和鍛煉機(jī)會，同時，也在一定程度上對育幼期的幼仔造成應(yīng)激，限制了幼仔公獸先天性本能的激發(fā)和發(fā)育，最終可能會導(dǎo)致圈養(yǎng)大熊貓自然行為的喪失(Zhu.，2001；Garshelis，2004)。與育幼期近自然的全母乳育幼方式相比，非自然的人工輔助育幼方式會造成圈養(yǎng)成年大熊貓刻板行為的頻繁發(fā)生(Zhang.，2021)，同時，育幼期不同的育幼方式(全母乳近自然育幼vs.人工輔助育幼)會顯著影響雄性大熊貓幼仔成年后的自然交配行為的表達(dá)以及繁殖效率(Zhang.，2021)。由此推測，育幼早期(幼仔0～4月齡)采取接近自然的育幼方式以及成長環(huán)境對大熊貓幼仔自然行為(尤其是自然交配行為)的表達(dá)非常重要。

目前，對于育幼期圈養(yǎng)大熊貓的應(yīng)激方面以及育幼經(jīng)歷對幼仔行為發(fā)育影響方面的研究較少，集中在母獸育幼行為表達(dá)的環(huán)境影響因素方面(Zhang.，2000；Snyder.，2016；Heiderer.，2018)。雖然中國大熊貓保護(hù)研究中心以及奧地利維也納動物園等都曾經(jīng)嘗試為臨產(chǎn)大熊貓修建人工育幼巢穴，使其像野生大熊貓一樣進(jìn)行自然的育幼，但這對于幼仔的行為發(fā)育以及成年后的自然交配能力是否有影響卻沒有報道(Snyder.，2003；Li.，2017)。Heiderer等(2018)首次介紹了奧地利動物園利用人工育幼巢穴成功育幼大熊貓雙胞胎的案例，重點(diǎn)介紹了育幼期雙胞胎與母獸的行為情況；Snyder等(2016)對圈養(yǎng)大熊貓育幼期母獸及幼仔的行為作了比較全面的描述，并得到了經(jīng)產(chǎn)母獸比初產(chǎn)母獸有更好育幼行為的結(jié)果；雖然Snyder等(2003)的研究結(jié)果顯示，母子分離對雄性和雌性幼仔行為的影響不同，且同伴養(yǎng)育不能給幼仔提供與母獸養(yǎng)育相同水平的社會刺激，但此實(shí)驗(yàn)沒有研究母子分離對成年大熊貓福利的影響。同時，圈養(yǎng)環(huán)境中多種非自然應(yīng)激源(游客噪音、更換獸舍以及非自然的多種氣味等)，也是造成圈養(yǎng)大熊貓心理應(yīng)激的重要因素。飼養(yǎng)模式對大熊貓行為以及生理免疫方面影響的研究集中在環(huán)境豐容(活動空間、環(huán)境豐富度等)和物件豐容(新奇事物刺激)對圈養(yǎng)大熊貓刻板行為、行為多樣性以及活動節(jié)律等方面(Liu.，2003；Swaisgood.，2005；Liu.，2006；Liu.，2017)。目前能夠反映圈養(yǎng)大熊貓應(yīng)激水平的激素類指標(biāo)并不多，最具代表性的為糞便和尿液中皮質(zhì)醇的含量(Owen.，2004；Liu.，2006)。

因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究旨在探討育幼期不同的育幼模式對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量的影響，了解圈養(yǎng)育幼模式可能引發(fā)成年雌性大熊貓的應(yīng)激問題，為完善育幼期圈養(yǎng)大熊貓圈舍的設(shè)計，以及提高圈養(yǎng)大熊貓的福利水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇成都大熊貓繁育研究基地9只育幼期成年雌性大熊貓為研究對象，分為3組，每組3只：第一組是母獸生育單胎幼仔，采取全母乳育幼的方式；第二組是母獸生育單胎幼仔，采取母獸和人工交替的常規(guī)人工輔助育幼的方式；第三組是母獸生育雙胎幼仔，采取母獸和人工交替的常規(guī)人工輔助育幼的方式。

1.2 育幼期的管理

幼仔1.5～2歲自然斷奶前，與母獸共同生活在育幼期圈舍內(nèi)，待幼仔可以走動后，讓其與母獸隨意選擇圈舍內(nèi)、圈舍外出入。斷奶后采取逐步分離母子的方式，減少分離產(chǎn)生的應(yīng)激。

無論是全母乳育幼還是常規(guī)人工輔助育幼，前期(幼仔0～3月齡)均在圈舍中進(jìn)行。單胎全母乳的育幼方式中幼仔主要與母獸一起飼養(yǎng)，母獸與幼仔分離的機(jī)會少、時間短(幼仔每次離開母獸進(jìn)行體檢或人工補(bǔ)奶的時間不超過2 min，整個育幼前期幼仔離開母獸的總時間不超過180 min)。為保證幼仔的健康，獸舍兩側(cè)增加了2扇推拉門，幼仔發(fā)生突發(fā)情況時可透過圈舍欄桿開門取出。常規(guī)人工輔助育幼的方式中幼仔主要在保溫箱中生活，與母獸經(jīng)常分離。

1.3 不同的育幼方式和經(jīng)驗(yàn)對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量的影響

收集育幼期第1周、第4周、第8周和第12周(每周3 d)成年雌性大熊貓的晨尿樣品(07∶00—09∶00)，-20 ℃保存。所有尿液樣本均從堅實(shí)、清潔的地板上吸出，不與糞便或水接觸，避免交叉污染和稀釋。

利用ELISA方法檢測尿液皮質(zhì)醇含量。相關(guān)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋液的配制方法與步驟按照Cayman的尿液Cortisol ELISA Kit 試劑盒的要求進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)品制備：準(zhǔn)備6支干凈試管，分別標(biāo)號100、50、25、12.5、6.25和0。用肌酐標(biāo)準(zhǔn)品原液(100 μg·mL，4 ℃保存)和TRIZMA Buffer進(jìn)行2倍稀釋：向標(biāo)號100的試管加入400 μL肌酐標(biāo)準(zhǔn)品原液，室溫放置恢復(fù)至常溫，渦旋充分混勻，標(biāo)號0～50的試管分別加入 200 μL TRIZMA Buffer，從標(biāo)號100的試管吸取 200 μL 肌酐標(biāo)準(zhǔn)品原液至標(biāo)號50的試管，充分渦旋混勻；再從標(biāo)號50的試管吸取200μL肌酐標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至標(biāo)號25的試管，充分渦旋混勻；再從標(biāo)號25的試管吸取200 μL肌酐標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至標(biāo)號12.5的試管，充分渦旋混勻；再從標(biāo)號12.5的試管吸取200 μL肌酐標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至標(biāo)號6.25的試管，充分渦旋混勻。

1)加樣：取干凈的96孔酶標(biāo)板標(biāo)記肌酐字樣，向前4個孔分別加入50 μL配好的肌酐標(biāo)準(zhǔn)品(0～100，每個稀釋度加2個孔)，從第5個孔開始，每個孔加入待測尿樣稀釋液50 μL(每個稀釋度加2個孔)；每個孔用排槍隔空分別依次加入50 μL ddHO，50 μL 0.75N NaOH，50 μL 0.4 N苦味酸；輕晃酶標(biāo)板，室溫放置15 min后讀數(shù)。

2)讀板：492 nm波長下讀數(shù)。

A=肌酐含量(mg·mL)=[肌酐(μg·mL)×稀釋倍數(shù)]/1 000；B=皮質(zhì)醇含量(pg·mL)=每孔皮質(zhì)醇含量(pg/well)×稀釋倍數(shù)；C=肌酐矯正皮質(zhì)醇含量(cortisol ng/mg Cr)=B/A/1 000。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

生理指標(biāo)結(jié)果表明，育幼早期(前8周)的育幼時間和育幼方式均對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量有顯著影響(育幼時間：=165.682，<0.01；育幼方式：=75.091，<0.01)，其中，隨著幼仔年齡增長，圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量顯著增加；在育幼期第1、4和8周，人工輔助育幼組母獸的尿液皮質(zhì)醇含量顯著高于全母乳育幼單胎組；育幼方式與育幼時間之間的交互作用明顯(=3.841，<0.01；圖1)。

圖1 育幼期不同的育幼方式和時間對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 1 Effects of different nursing methods and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period

**<0.01；下同the same below

育幼早期(前12周)的育幼時間和育幼經(jīng)驗(yàn)對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量均有顯著的影響(育幼時間：=91.531，<0.01；育幼經(jīng)驗(yàn)：=58.305，<0.01)，其中，育幼期第4周和第12周，經(jīng)產(chǎn)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量均顯著低于初產(chǎn)；另外，隨著幼仔年齡增長，圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量均顯著增加；但育幼經(jīng)驗(yàn)與育幼時間之間的交互作用不明顯(=1.940，=0.151；圖2)。

圖2 育幼期不同的育幼經(jīng)驗(yàn)和時間對圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量的影響Fig. 2 Effects of different nursing experience and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，育幼期前12周，采取人工輔助育幼方式的成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇的含量顯著高于采取全母乳育幼方式，這表明，人工輔助育幼的方式對育幼期圈養(yǎng)成年雌性大熊貓產(chǎn)生了應(yīng)激，這也補(bǔ)充了我們前期的行為學(xué)研究結(jié)果：人工輔助的育幼方式減少了育幼期母獸與幼仔在一起的時間，導(dǎo)致母獸在與幼仔分離后產(chǎn)生頻繁的踱步以及針對欄桿祈求幼仔等刻板行為(Zhang.，2021)。動物福利學(xué)者認(rèn)為，刻板行為的出現(xiàn)可能標(biāo)志著動物對生存環(huán)境的不適應(yīng)以及正在遭受心理痛苦(Broom，1986)。除了行為表現(xiàn)外，激素水平也在一定程度上反映了圈養(yǎng)大熊貓存在心理不適的問題。前人研究發(fā)現(xiàn)，不利環(huán)境因素(噪音等)會造成圈養(yǎng)大熊貓糞便和尿液皮質(zhì)醇水平顯著升高(Owen.，2004；Liu.，2006；Powell.，2006)。大量人類臨床研究證實(shí)，慢性心理應(yīng)激與下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能紊亂有關(guān)，而皮質(zhì)醇正是調(diào)節(jié)該軸功能的重要激素，即過量的皮質(zhì)醇水平預(yù)示著心理不適的存在(Sapolsky.，2000)。在幼仔離開后，母獸心理受到了嚴(yán)重的創(chuàng)傷，而這可能與育幼前期母獸的母性行為被激發(fā)但表達(dá)受到人為抑制有關(guān)。Latham和Mason(2008)的報道也已經(jīng)證實(shí)了育幼期過早的母子分離會促進(jìn)幼仔刻板行為的發(fā)育，而本實(shí)驗(yàn)做了很好的補(bǔ)充，證明了育幼期長時間的母子分離也會導(dǎo)致母獸尿液皮質(zhì)醇含量的顯著上升。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，有育幼經(jīng)驗(yàn)的經(jīng)產(chǎn)圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液皮質(zhì)醇含量顯著低于沒有育幼經(jīng)驗(yàn)的初產(chǎn)母獸，這說明，經(jīng)產(chǎn)的圈養(yǎng)母獸在育幼前期的應(yīng)激水平低于初產(chǎn)的母獸，也從側(cè)面說明具有育幼經(jīng)驗(yàn)的經(jīng)產(chǎn)母獸對環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)，這可能與經(jīng)驗(yàn)效應(yīng)有關(guān)。前期對妊娠期母豬的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，有妊娠期限位經(jīng)驗(yàn)的母豬要比初次經(jīng)歷限位飼養(yǎng)的表現(xiàn)出更少的刻板行為以及應(yīng)激相關(guān)的血液皮質(zhì)醇、IgA和IL-6含量更低，這說明不利的經(jīng)驗(yàn)效應(yīng)可以緩解動物的應(yīng)激水平，使其更容易適應(yīng)不利的生存環(huán)境(Zhang.，2017)。同時，育幼前期不同的育幼環(huán)境應(yīng)激是否對幼仔的行為發(fā)育(尤其是自然交配行為的表達(dá))以及性格等情緒認(rèn)知方面有影響還不清楚(Zhang.，2017)，有待后期繼續(xù)深入的研究。

由于每年圈養(yǎng)大熊貓繁育數(shù)量有限，試驗(yàn)樣本量較小，在統(tǒng)計分析中有可能出現(xiàn)假顯性現(xiàn)象，希望后期積累新的圈養(yǎng)大熊貓育幼數(shù)據(jù)以驗(yàn)證本試驗(yàn)的結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與全母乳育幼方式相比，人工輔助育幼的方式會使圈養(yǎng)成年雌性大熊貓尿液中皮質(zhì)醇的含量顯著升高，造成嚴(yán)重的心理焦慮。因此，在圈養(yǎng)環(huán)境下，采取全母乳育幼的方式是符合大熊貓自然育幼特點(diǎn)且有利于母獸福利的育幼方式。

感謝給予本研究幫助的成都大熊貓繁育研究基地的大熊貓飼養(yǎng)員和工作人員。