LPS處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中差異miRNA分析

張?zhí)扃?，許浩天，趙文蘋，李思妍，連 帥，王建發(fā)，武 瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院 黑龍江省牛病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

奶牛乳腺既是合成牛乳的唯一場所，也是牛體重要疾病高發(fā)組織，由于奶牛乳腺組織具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、生理功能和組織微環(huán)境，含有獨(dú)特的細(xì)胞亞群和功能分子，面臨多種致病微生物的威脅，從而形成了獨(dú)特的區(qū)域免疫特性[1]。乳腺上皮細(xì)胞是細(xì)菌感染與乳腺免疫的初始交匯處。在這個初始交匯處，乳腺上皮細(xì)胞既是抵御病原微生物入侵的天然屏障，同時也啟動了機(jī)體對病原微生物最早的免疫識別和免疫應(yīng)答，并發(fā)揮了協(xié)調(diào)后續(xù)免疫分子、免疫細(xì)胞應(yīng)答的重要作用[2]。外泌體是細(xì)胞主動向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體，可借助內(nèi)部包裹的miRNA等成分，影響細(xì)胞遷移、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等生物過程[3]。奶牛乳腺感染時上皮細(xì)胞外泌體分揀的miRNA可能發(fā)生改變，進(jìn)而影響乳腺炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。系統(tǒng)研究乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞外泌體miRNA變化，將有助于全面認(rèn)識乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞的第一道防線作用，對科學(xué)防控奶牛乳腺疾病具有重要意義。

SUN等[4]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌感染奶牛后，乳汁外泌體中包裹的14種miRNA發(fā)生改變，其中bta-miR-2285g-3p、378b、502b、396-5p等顯著上調(diào)，bta-miR-223、142-5p、1246、10a等顯著下調(diào)。JIN等[5]比較了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞后miRNA表達(dá)模式變化情況，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌感染后bta-miR-2339、499、23a和99b發(fā)生了顯著變化，金黃色葡萄球菌感染后bta-miR-184、24-3p、148、486和let-7a-5p發(fā)生了顯著變化[5]。LUORENG等[6]研究了感染大腸桿菌、金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺組織中miRNA表達(dá)模式的影響，認(rèn)為bta-miR-144、451和7863可作為奶牛乳腺大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的標(biāo)志性miRNA。ZHANG等[7]鑒定出奶牛乳腺上皮外泌體中存在638種蛋白質(zhì)，使用蛋氨酸和雌二醇刺激乳腺上皮細(xì)胞后所產(chǎn)生外泌體中6種蛋白的表達(dá)量增加。前述研究主要關(guān)注乳腺感染時，乳腺組織整體、乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)和乳汁外泌體miRNA變化情況，奶牛乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞的第一道防線作用仍未被充分揭示。

本研究利用超速離心法分離脂多糖(LPS)處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞外泌體，利用多種外泌體表征方法對外泌體進(jìn)行表征，利用高通量測序和分析方法篩選了LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中差異miRNA，預(yù)測量差異miRNA的靶基因及其功能聚類，旨在分析乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞外泌體中miRNA變化，為系統(tǒng)認(rèn)識奶牛乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞的免疫防御機(jī)制提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞處理方法按照實(shí)驗(yàn)室前期研究[8]，采用酶消化法分離鑒定奶牛乳腺上皮細(xì)胞(DCMECs)。將DCMECs接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至80%融合后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去除培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后每孔分別加入含LPS(寶信生物)質(zhì)量濃度為0，5，10，25，50，100 mg/L的培養(yǎng)基，孵育不同時間，進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(MTT，碧云天)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，確定LPS的刺激濃度和刺激時間。

1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞透射電鏡觀察方法將生長在蓋玻片或聚苯乙烯蓋片上的單層細(xì)胞取出，置青霉素瓶內(nèi)，用4℃ PBS緩沖液漂洗3次。2%冷的戊二醛固定30 min，冷PBS緩沖液漂洗3次，1%鋨酸固定30 min，PBS緩沖液漂洗過夜。脫水、滲透后將明膠囊裝滿混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，60℃固化2 h，分離蓋片與包埋劑，透射電鏡(日立H-7650)觀察細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞外囊泡數(shù)量。

1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞外泌體分離方法使用超速離心法分離細(xì)胞外泌體，簡要步驟如下：將乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清分裝于50 mL離心管內(nèi)；按照300×g10 min、2 000×g10 min、10 000×g30 min、100 000×g70 min、再次100 000×g70 min 程序低溫超速離心(貝克曼庫爾特)，用100 μL PBS緩沖液重懸沉淀。將收集到的樣品轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外泌體形態(tài)學(xué)鑒定方法取5 μL外泌體樣品，用PBS稀釋至25 μL，滴加于有碳涂層的銅網(wǎng)上沉淀1 min，滴加3%的磷鎢酸溶液30 μL，用濾紙從邊緣處吸去多余的液體，干燥2 min。用透射電子顯微鏡(日立H-7650)進(jìn)行成像，觀察外泌體形態(tài)。

1.5 外泌體RNA提取、文庫構(gòu)建和測序使用苯酚/氯仿萃取法提取外泌體中總RNA，采用TruSeq RNA Sample Prep Kit試劑盒構(gòu)建小RNA文庫(Illumina)，用生物分析儀(安捷倫2100)進(jìn)行文庫質(zhì)檢。利用Quant-iT picoGreen dsDNA Assay Kit試劑盒(賽默飛世爾)對文庫進(jìn)行定量，采用HiSeq 2500測序儀(Illumina)Hiseq Single-End模式測序，獲得樣品中總RNA的序列原始數(shù)據(jù)。

1.6 RNA測序數(shù)據(jù)分析序列原始數(shù)據(jù)分析：采用去接頭軟件去除接頭序列(派森諾基因)，過濾序列用于后續(xù)分析。對序列長度在18～36 nt之間的過濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。對單樣品內(nèi)完全相同的序列進(jìn)行去重復(fù)處理并統(tǒng)計(jì)序列豐度。

miRNA 序列比對和注釋：利用miRDeep2軟件(德國馬克斯·德爾布呂克研究所)，結(jié)合miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)進(jìn)行去重復(fù)序列與參考基因組序列間的比對。將去重序列比對到本物種在miRBase庫中的成熟miRNA和前體miRNA序列。

新miRNA預(yù)測：使用mireap軟件分析未注釋到任何信息的序列，并進(jìn)行新miRNA預(yù)測分析。

差異表達(dá)分析：根據(jù)各樣品中miRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用DESeq(德國馬克斯·德爾布呂克研究所)對miRNA進(jìn)行差異分析，并按照表達(dá)量倍數(shù)差異(|fold change|>2)和表達(dá)差異顯著性(P<0.05)篩選出差異的保守miRNA。

1.7 差異miRNA靶基因預(yù)測及GO和KEGG富集分析使用miranda數(shù)據(jù)庫(http://www.microrna.org/)，以牛mRNA的3′UTR序列為目標(biāo)序列，對差異表達(dá)的miRNA序列，進(jìn)行靶基因預(yù)測。利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)分析差異miRNA靶基因富集于何種生物功能。利用KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)分析差異miRNA靶基因富集于何種信號通路。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激濃度和刺激時間篩選如圖1A所示，乳腺上皮細(xì)胞活力隨著LPS刺激濃度的增加而逐漸降低，10 mg/L質(zhì)量濃度的LPS刺激24 h后，乳腺上皮細(xì)胞活力與對照組相比極顯著降低(P<0.01)。采用10 mg/L的LPS處理乳腺上皮細(xì)胞6 h 后，用透射電鏡法觀察乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖1B可見，10 mg/L的LPS處理乳腺上皮細(xì)胞6 h，對其線粒體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)、高爾基體結(jié)構(gòu)均無明顯影響，但乳腺上皮細(xì)胞外泌體(黑色箭頭)分泌數(shù)量減少。結(jié)合上述結(jié)果，后續(xù)研究使用10 mg/L的LPS處理乳腺上皮細(xì)胞6 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清并提取外泌體。

A.不同濃度LPS孵育24 h后對奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響；B.LPS處理6 h后奶牛乳腺上皮細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果(×6 000)，黑色箭頭所指為外泌體

2.2 外泌體鑒定采用透射電鏡對所提取樣品形態(tài)進(jìn)行觀察，由圖2可見，2組外泌體大小均一，直徑均在40～150 nm之間，呈圓形或橢圓形的茶托樣膜泡結(jié)構(gòu)，符合外泌體的形態(tài)學(xué)特征。

圖2 外泌體透射電鏡形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(標(biāo)尺為200 nm)

2.3 RNA測序過濾去除重復(fù)序列后，對照組外泌體序列數(shù)為11 926 357，LPS處理后外泌體序列數(shù)為12 349 937。將過濾后miRNA序列與miRBase數(shù)據(jù)庫中牛類成熟miRNA和前體miRNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對照組外泌體中含有400種牛成熟miRNA和443種牛前體miRNA，LPS處理后外泌體中含有189種牛成熟miRNA和204種牛前體miRNA。證實(shí)LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中分揀的miRNA數(shù)量顯著減少。此外，LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中分揀的核仁小RNA(snoRNA)和核小RNA(snRNA)數(shù)量也大幅減少，但分揀的rRNA和tRNA數(shù)量增加，包含的未知功能的RNA數(shù)量也較對照組增多。使用軟件mireap對上述結(jié)果中未注釋的序列進(jìn)行新miRNA預(yù)測，共預(yù)測到新miRNA 124種。

2.4 差異miRNA分析利用DESeq軟件對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析，比較正常奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌外泌體和LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中miRNA表達(dá)情況。由表1可見，LPS刺激后，外泌體中共有43個表達(dá)差異的miRNA，其中miR-125a、125b、205、451等21個miRNA顯著上調(diào)，miR-11987、11977、133a、2285aw等23個miRNA顯著下調(diào)。

表1 LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中 主要差異miRNA信息

2.5 差異miRNA靶基因分析43個差異表達(dá)miRNA對應(yīng)43 784個靶基因，其中miR-451的靶基因最少，只有168個，miR-15b的靶基因最多，有1 975個，表2為選取的部分高評分值miRNA靶基因。由表可見，預(yù)測的差異miRNA靶基因主要包括活化白細(xì)胞黏附分子(CD166)、Ig樣細(xì)胞黏附分子(Ig-CAM)、免疫球蛋白基因超家族成員5(IGSF5)、血小板生成素(THPO)、類血管動蛋白-2、電壓門控性鉀通道E1(KCNE1)、β-羥丁酸脫氫酶(3HBDH)等與白細(xì)胞黏附、免疫應(yīng)答、血管通透性、酮體代謝功能有關(guān)的基因。

表2 LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中主要差異miRNA靶基因信息

將差異miRNA靶基因進(jìn)行GO與KEGG pathway顯著性富集分析，可見其靶基因主要參與蛋白結(jié)合、代謝過程、細(xì)胞通訊調(diào)節(jié)等生物過程(圖3)，靶基因主要參與癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、腫瘤壞死因子信號通路、Th17細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)機(jī)制、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號通路(圖4)。

圖3 差異miRNA靶基因GO分析

圖4 差異miRNA靶基因KEGG通路分析

3 討論

以往對乳汁外泌體的研究普遍關(guān)注其對人體免疫功能或幼畜發(fā)育的影響[9-12]，未見乳腺上皮細(xì)胞外泌體調(diào)控動物本身免疫功能的報(bào)道。本研究所分離外泌體粒徑較ZHANG等[7]分離的奶牛乳腺上皮細(xì)胞外泌體粒徑(平均小于50 nm)更大。國際上將由多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成的直徑為30～200 nm 的細(xì)胞外囊泡稱為外泌體[13]。因此，本研究分離的樣品更符合外泌體粒徑的分類標(biāo)準(zhǔn)。LPS刺激間充質(zhì)干細(xì)胞后外泌體分泌量增加[14]，本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，外泌體濃度及其分揀miRNA種類減少，這可能與乳腺上皮細(xì)胞屬于分泌型細(xì)胞的特性有關(guān)，確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中23個miRNA顯著下調(diào)。其中，miR-125a可以通過靶向趨化因子4基因抑制人血管平滑肌細(xì)胞炎癥小體NLRP3[15]，而LPS可以激活NLRP3炎癥小體進(jìn)而誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥性壞死[16]。miR-125a上調(diào)可能與抑制NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的炎癥性壞死有關(guān)。miR-125b存在于人乳汁和牛奶中，LPS刺激牛單核細(xì)胞后可上調(diào)miR-125b表達(dá)[17]，牛感染副結(jié)核分枝桿菌6個月后血清中miR-205表達(dá)量提高2倍[18]，提示miR-125b、205可能與?？寡酌庖吖δ芟嚓P(guān)。金黃色葡萄球菌感染奶牛乳腺組織miR-451、144表達(dá)量上調(diào)，而大腸桿菌感染奶牛乳腺組織miR-451、144表達(dá)量下調(diào)[6]，推測可能與外泌體分揀miR-451、144量增多有關(guān)。在23種顯著下調(diào)的miRNA中，miR-133a具有較廣泛的生物學(xué)功能，可調(diào)控牛背最長肌發(fā)育[19]，在熱應(yīng)激和脂肪組織能量代謝平衡調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激乳腺上皮細(xì)胞后外泌體中bta-miR-133a分揀量下調(diào)，可能與乳腺上皮細(xì)胞脂代謝功能改變有關(guān)，確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在主要差異miRNA可能的靶基因中，CD166是一種屬于免疫球蛋白受體超家族的細(xì)胞表面黏附分子，可并促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[22]。miR-148a下調(diào)表達(dá)4.6倍可促進(jìn)CD166表達(dá)，這可能與乳腺炎癥過程中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關(guān)。THPO又稱巨核細(xì)胞生長衍生因子，對巨核細(xì)胞的生長分化和血小板生成具有刺激作用。在炎癥過程中，活化的血小板與中性粒細(xì)胞結(jié)合后可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的黏附、遷移和胞外誘補(bǔ)網(wǎng)的形成功能[23]。因此，miR-15b、205、34a、34b可能共同靶向THPO基因，進(jìn)而調(diào)控中性粒細(xì)胞功能。3HBDH是從球形紅桿菌中提取的一種酶，可以使β羥丁酸脫氫[24]，miR-125a和125b上調(diào)可抑制3H-BDH表達(dá)，這可能與乳腺上皮細(xì)胞脂代謝功能改變有關(guān)。

MAPK通路是細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、凋亡等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同交匯通路之一[25]。差異miRNA靶基因聚類于MAPK通路可能與LPS引發(fā)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥有關(guān)。內(nèi)吞作用是通過質(zhì)膜的變形運(yùn)動將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)的過程[26]，所預(yù)測差異miRNA靶基因聚類于內(nèi)吞通路可能與外泌體的形成過程有關(guān)。RAS信號傳導(dǎo)途徑是起始于酪氨酸激酶受體的一種重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)方式，Ras通過催化其效應(yīng)底物來調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞生長、分化、凋亡有關(guān)的重要功能[27]，所預(yù)測差異miRNA靶基因聚類于RAS通路可能與LPS引發(fā)的乳腺上皮細(xì)胞狀態(tài)改變有關(guān)。

此外，本研究還對乳腺上皮細(xì)胞外泌體中的新miRNA進(jìn)行了預(yù)測，累計(jì)預(yù)測出124種符合新miRNA特征的序列。這些研究為進(jìn)一步分析乳腺感染時乳腺上皮細(xì)胞外泌體中miRNA的功能作用提供了基礎(chǔ)。