葛根素激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖

鄭文靜，陳智華，史冬雪,范希萍，韓曉梅,馬 茜，賴 鑫

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

骨質(zhì)疏松癥是骨科常見疾病之一，臨床表現(xiàn)為骨的微觀結(jié)構(gòu)疏松、薄弱、骨量下降為特征，導(dǎo)致骨脆性以及骨折患病率增加[1]。引起骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要原因之一是大齡動(dòng)物及絕育后動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的雌激素含量減少，引起動(dòng)物機(jī)體內(nèi)破骨細(xì)胞分化水平增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)密度降低，骨吸收率、骨的消融率增加，出現(xiàn)骨鈣沉積和不同程度骨質(zhì)丟失等癥狀[2]。有關(guān)研究表明[3-5]，雌激素作為類固醇激素，可以通過激素受體調(diào)節(jié)途徑，調(diào)節(jié)骨的增殖、分化和凋亡，對(duì)骨質(zhì)生成和骨量的維持有著重要影響，但長(zhǎng)期使用雌激素產(chǎn)生副作用會(huì)提升患乳腺腫瘤及心血管等疾病風(fēng)險(xiǎn)的概率。葛根素化學(xué)結(jié)構(gòu)為4,7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，是一種副作用極小的植物類雌激素，有著能與人體內(nèi)的雌激素受體相結(jié)合增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性功能，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療有重要影響[6]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路具有調(diào)控動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及炎癥反應(yīng)等作用，也是成骨細(xì)胞增殖分化的主要信號(hào)通路，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)3條信號(hào)通路[7-8]，其中，ERK1/2信號(hào)通路幫助提升成骨細(xì)胞ALP活性，刺激成骨細(xì)胞的細(xì)胞周期，是骨髓間質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)成骨細(xì)胞定向增殖、分化與成熟的重要信號(hào)通路[9-10]?，F(xiàn)階段葛根素通過ERK1/2信號(hào)通路機(jī)制對(duì)成骨細(xì)胞有增殖影響的研究較少，為此本研究擬在細(xì)胞水平以及分子水平上研究葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖所產(chǎn)生的作用，通過抑制MAPK信號(hào)通路中ERK1/2活性，觀察MC3T3-E1細(xì)胞増殖過程中標(biāo)志物及其蛋白的表達(dá)情況，探究葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的作用機(jī)制并闡明其間所涉及的信號(hào)通路，為葛根素防治骨質(zhì)疏松提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株MC3T3-E1小鼠胚胎成骨前體細(xì)胞購(gòu)自百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 主要試劑葛根素(PUE，濃度>98%)購(gòu)自河南萬佳首化生物科技有限公司；胎牛血清(LFBS)、胰酶消化液購(gòu)自以色列B1公司；MEMα培養(yǎng)基(SH30265.01)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；SCH772984(ERK1/2信號(hào)通路抑制劑)、二甲基亞砜(DMSO 純度99.5%)、pNPP試劑盒、CCK-8試劑盒、蛋白裂解液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.2～7.4)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自(武漢，BOSTER生物)；Ⅰ型膠原ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇寶萊生物科技有限公司；GAPDH一抗購(gòu)自美國(guó)proteintech公司；p-ERK1/2一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3 試劑配制細(xì)胞培養(yǎng)基制備：100 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(89 mL MEMα細(xì)胞培養(yǎng)液+10 mL FBS+1 mL 雙抗(青霉素-鏈霉素)。

葛根素濃度梯度溶液配制：取20 μL DMSO加入20 mg葛根素與180 μL的細(xì)胞培養(yǎng)基混勻，使?jié)舛认♂尀?0-2mol/L。從濃度為10-2mol/L的溶液中吸取0.55 mL液體，混合于4.95 mL的細(xì)胞培養(yǎng)基中,終濃度為10-3mol/L；以此類推配制濃度為10-4，10-5，10-6，10-7mol/L的4組藥物。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇(水浴恒溫鍋，37℃)，復(fù)蘇好的MC3T3-E1細(xì)胞液移入離心管中，離心(1 000 r/min，10 min)。離心后棄上清液，加入培養(yǎng)液接種于細(xì)胞瓶中，置于培養(yǎng)箱中(37℃、5% CO2)培養(yǎng)。

1.5 CCK-8試劑盒測(cè)定各濃度梯度葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活力取生長(zhǎng)穩(wěn)定的MC3T3-E1細(xì)胞，PBS洗2次，加入0.25%胰酶消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL。滴加100 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，于細(xì)胞懸液周圍加入PBS溶液，待細(xì)胞貼壁后，96孔板中添加不同濃度梯度葛根素培養(yǎng)(24 h)。取出96孔板，將10 μL的CCK-8溶液加入各孔中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃,3 h),在450 nm的條件下測(cè)各孔吸光度值，做6組重復(fù)試驗(yàn)，篩選出葛根素促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳濃度。

選取葛根素的最佳濃度加入MC3T3-E1細(xì)胞液中繼續(xù)培養(yǎng)，CCK-8試劑盒分別檢測(cè)培養(yǎng)24，36，48和60 h時(shí)間段的細(xì)胞活力，記錄450 nm的條件下測(cè)各孔吸光度值，篩選出MC3T3-E1細(xì)胞增殖的最佳作用時(shí)間。

1.6 pNPP法檢測(cè)各濃度梯度葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP的活性在96孔板中加入不同濃度梯度的葛根素細(xì)胞培養(yǎng)液(同1.5)100 μL，用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次，加入75 μL RIPA裂解液，將顯色底物充分溶解于檢測(cè)緩沖液中,置恒溫箱孵育(37℃,30 min)， 終止反應(yīng)(添加反應(yīng)終止液100 μL)后，在450 nm的條件下測(cè)定吸光度值，D值高代表細(xì)胞ALP活性強(qiáng)。

1.7 葛根素激活ERK1/2信號(hào)通路對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的影響

1.7.1CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞培養(yǎng)步驟同1.4。滴加100 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，于細(xì)胞懸液周圍加入PBS溶液，細(xì)胞貼壁后棄廢液，在96孔板加入培養(yǎng)液，將試驗(yàn)分為空白組(細(xì)胞培養(yǎng)液)、葛根素組(濃度為10-6mol/L葛根素細(xì)胞培養(yǎng)液)、葛根素+ERK1/2抑制劑組(含ERK1/2通路抑制劑SCH772984的10-6mol/L葛根素細(xì)胞培養(yǎng)液)，培養(yǎng)48 h,每孔加入CCK-8溶液10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，酶標(biāo)儀上標(biāo)注450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光值。

1.7.2pNPP法測(cè)定細(xì)胞ALP活性 細(xì)胞培養(yǎng)步驟同1.4；其余操作步驟同1.6。

1.7.3Western blot檢測(cè)P-ERK1/2蛋白 提取空白組、葛根素組、葛根素+ERK1/2抑制劑組總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將空白組、葛根素組、葛根素+ERK1/2抑制劑組與4×蛋白上樣緩沖液按照3∶1的比例配置蛋白工作液。置該蛋白于金屬浴煮沸變性(100℃，10 min),制備SDS(聚丙烯酰氨凝膠電泳)，進(jìn)行電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜， BSA溶液封閉，搖床室溫封閉3 h。一抗4℃過夜，PBST清洗6次，每次10 min，添加二抗，室溫孵育1 h，PBST 清洗6次，每次10 min，滴加化學(xué)曝光液曝光，并用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白條帶圖像分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.7.4ELISA檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白含量 應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中的Ⅰ型膠原水平。不同分組的細(xì)胞樣品加入酶標(biāo)板孔底部，37℃溫箱30 min，棄廢液，甩干后洗滌，靜置30 s后棄掉，重復(fù)5次，拍干。除空白孔外，酶標(biāo)孔中添加酶標(biāo)試劑50 μL，室溫孵育30 min，洗滌5次，將顯色劑按順序添加到酶標(biāo)板中，混勻，37℃溫箱避光顯色10 min，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm時(shí)的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8、pNPP法檢測(cè)各濃度梯度葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化通過CCK-8試劑盒，pNPP法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)各濃度梯度葛根素組對(duì)比空白對(duì)照組時(shí)，濃度為10-7～10-4mol/L葛根素組測(cè)出的D值均較高(0.01≤P<0.05)，其中濃度為10-6mol/L葛根素組的D值排第1(表1)，表明濃度為10-7～10-4mol/L的葛根素都能促進(jìn)MC-3T3-E1細(xì)胞增殖分化，在濃度為10-6mol/L時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖分化作用更為顯著(0.01≤P<0.05)；與之相反，10-3mol/L的葛根素促進(jìn)該細(xì)胞增殖分化作用較弱，因此濃度越高，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化能力越弱。

表1 CCK-8、pNPP法檢測(cè)細(xì)胞增殖分化的結(jié)果

根據(jù)表1結(jié)果，10-6mol/L的葛根素是促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的最適濃度，用該濃度葛根素作用于MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)(24，36，48，60 h)。CCK-8法檢測(cè)該不同時(shí)間段細(xì)胞增殖情況，記錄D值(450 nm)，結(jié)果見圖1，濃度為10-6mol/L的葛根素在48 h的D值最高，表明10-6mol/L葛根素在48 h對(duì)MC3T3-E1促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最顯著，選擇此最佳作用時(shí)間進(jìn)行葛根素激活ERK1/2信號(hào)通路中的相關(guān)試驗(yàn)。

不同字母表差異顯著(0.01≤P<0.05)，相同字母表差異不顯著(P≥0.05)。下同

2.2 葛根素激活ERK1/2信號(hào)通路對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化的影響將試驗(yàn)分為空白對(duì)照組(NC)、葛根素組(PUE)和葛根素+ERK1/2抑制劑組(PUE+SCH772984)，分別作用于MC3T3-E1細(xì)胞，CCK-8試劑盒、pNPP法檢測(cè)細(xì)胞活力和堿性磷酸酶活性情況(D450 nm、D405 nm),結(jié)果如表2所示。葛根素組與空白組相比D值均升高，表明葛根素組促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化作用顯著(0.01≤P<0.05)；葛根素組與葛根素+ERK1/2信號(hào)通路抑制劑組相比，加入信號(hào)通路抑制劑的D值顯著降低，表明葛根素可以通過激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化。

表2 CCK-8、pNPP法檢測(cè)細(xì)胞增殖分化的結(jié)果

ELISA檢測(cè)Ⅰ型膠原活性：將96孔板從培養(yǎng)箱中取出，取細(xì)胞樣對(duì)應(yīng)加入ELISA微孔板，采用雙抗體夾心法，檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的分泌水平。結(jié)果如表3所示，與空白組相比，葛根素組促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原作用顯著(0.01 ≤P<0.05)；與葛根素組相比，葛根素+ERK1/2信號(hào)通路抑制劑組能夠明顯抑制MC3T3-E1細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原。表明葛根素可以通過激活ERK1/2信號(hào)通路增強(qiáng)MC3T3-E1細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白的能力，從而促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞分化。

表3 ELISA檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原 D450 nm

2.3 葛根素對(duì)p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響進(jìn)一步分析葛根素通過ERK1/2通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化潛在機(jī)制，提取每個(gè)試驗(yàn)組蛋白，按Western blot試驗(yàn)步驟進(jìn)行操作可得出p-ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)水平的情況，進(jìn)行灰度數(shù)據(jù)分析。結(jié)果如圖2所示。與空白組相比，葛根素組ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)顯著上升。與葛根素組相比，葛根素+ERK1/2信號(hào)通路抑制劑組對(duì)磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)的表達(dá)有明顯抑制作用。說明葛根素可以通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)提升MC3T3-E1細(xì)胞的增殖情況。

圖2 葛根素與MAPK信號(hào)通路抑制劑對(duì)ERK1/2信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松的研究一直是骨組織工程領(lǐng)域中最熱門的課題之一，抑制成骨細(xì)胞增殖分化是骨質(zhì)疏松癥的主要致病機(jī)理[11]。目前首要的治療方法通過雌激素代替療法，促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白、ALP等骨形成因子，加強(qiáng)成骨細(xì)胞形成骨基質(zhì)，因此雌性激素缺乏，更易誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥[12]。葛根素與雌激素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，可以抑制激素缺乏引起的骨丟失而且不增加雌激素樣的副作用[13-14]，因此開展探尋葛根素在骨代謝調(diào)節(jié)過程中的角色以及對(duì)骨髓的間質(zhì)干細(xì)胞影響成為研究領(lǐng)域的新型課題，王昌等[15]發(fā)現(xiàn)葛根素不僅能加快 Wistar 新生小鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞的增殖分化并且在抑制自體骨吸收方面起著重要作用； 孫玉敏等[16]研究表明葛根素對(duì)患有骨質(zhì)疏松老年病人的成骨細(xì)胞有明顯防治作用。本試驗(yàn)擬在細(xì)胞水平和分子水平上研究不同濃度葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖分化及其機(jī)制。MC-3T3-E1細(xì)胞是乳鼠源性胚胎前體細(xì)胞，該細(xì)胞ALP表達(dá)顯著且與成骨細(xì)胞特性相似，成為研究骨質(zhì)疏松癥的種子細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7～10-4mol/L 的葛根素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞有著不同程度的增殖分化影響，當(dāng)葛根素濃度為10-6mol/L，作用48 h時(shí)，對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化的作用最為明顯，但是當(dāng)葛根素濃度大于10-4mol/L時(shí)，使MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化能力降低。這對(duì)于防治骨質(zhì)疏松癥有重要意義。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，在成骨調(diào)節(jié)中起重要作用[17]。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外刺激時(shí)通過Raf-MEK1/2-ERK1/2激酶聯(lián)合將絲裂原信號(hào)從細(xì)胞漿膜傳到細(xì)胞核，活化MEK1/2，磷酸化ERK1/2參與成骨調(diào)控[18]細(xì)胞分化的重要標(biāo)志是成骨細(xì)胞增殖早期分泌的堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原，這可來判斷成骨細(xì)胞的分化能力[19-20]。丁道芳等[21]在通過抑制 MAPK(ERK1/2)信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性的試驗(yàn)中證實(shí)，Ⅰ型膠原、成骨性基因Runx2和ALP的表達(dá)程度會(huì)隨著干擾ERK1/2信號(hào)通路后逐漸下調(diào)，證實(shí)ERK1/2信號(hào)通路的激活能夠增強(qiáng)成骨基因表達(dá)促使成骨細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素組與空白組相比，10-6mol/L葛根素組MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用和堿性磷酸酶活性升高，Ⅰ型膠原及p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著上升；而干擾ERK1/2通路表達(dá)后，葛根素+ERK1/2信號(hào)通路抑制劑組MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用和堿性磷酸酶活性下降，Ⅰ型膠原及p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著降低，表明葛根素在調(diào)控體外MC3T3-E1細(xì)胞的增殖分化過程中，ERK1/2通路發(fā)揮了正向調(diào)控作用，從而使MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化。

以上結(jié)論可得出，葛根素通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)刺激MC3T3-E1成骨細(xì)胞周期提升分泌ALP和Ⅰ型膠原的能力，從而促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖分化，但其機(jī)理可能是多方向的，還需要進(jìn)一步研究。