多房棘球絳蟲TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

王冰潔，趙 莉，班萬里，段蘭利，郭 璐，陳云英，余婉蓉，張壯志*

(1.新疆畜牧科學(xué)院 獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊 830013；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

由泡球蚴(多房棘球絳蟲的幼蟲)寄生于動物或人體內(nèi)而致的多房棘球蚴病又稱泡型包蟲病(alveolar echinococcosis，AE)，是重要的人畜共患寄生蟲病。泡球蚴早期寄生于中間宿主的肝臟內(nèi)，導(dǎo)致局部肝臟組織病變乃至壞死，而無明顯臨床癥狀；晚期似肝癌樣轉(zhuǎn)移至肺臟、腦、乳腺等臟器而被稱為“蟲癌”，若不及時(shí)治療，10年病死率高達(dá)94%[1]，因此AE已成為人類致死率最高的慢性感染性疾病之一[2]。AE主要分布于北半球，呈局部地方性流行[3]，在我國主要分布于新疆、青海、西藏等西部牧區(qū)和半農(nóng)牧區(qū)[4]。由于我國西部牧區(qū)野生狐貍、放牧犬和嚙齒類動物分布廣泛，使得多房棘球絳蟲生活史存在復(fù)雜性，進(jìn)一步增加了宿主動物和人傳播和感染該病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此及時(shí)、準(zhǔn)確地監(jiān)測AE，對控制該病的流行、綜合防控措施的實(shí)施和防制效果的評價(jià)等都具有十分重要的意義。

目前主要使用B超、CT、X射線和磁共振(MRI)等[6-9]影像學(xué)方法以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)等[10]免疫學(xué)方法對該病進(jìn)行檢測。影像學(xué)檢查時(shí)，AE的一些非典型和體積較小的病灶常與肝癌和肝膿腫等相混淆[11]，免疫學(xué)檢測則因使用粗抗原而導(dǎo)致特異性較差，因此開發(fā)高度敏感、特異檢測AE的方法是控制該病的一種切實(shí)有效的方法，并且在使用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以多房棘球絳蟲NADH3基因的特異性引物和探針建立起了用于AE檢測的熒光定量PCR方法，可為該病的快速檢測、疫情監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 蟲株及臨床樣本多房棘球蚴(Echinococcusalveolar)、多房棘球絳蟲(E.m)、細(xì)粒棘球蚴(Echinococcuscystic)、細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，E.g)、腦多頭蚴(Coenuruscerebralis，C.c)、多頭多頭絳蟲(Multicepsmulticeps，M.m)、細(xì)頸囊尾蚴(Cysticercustenuicollis，C.t)、泡狀帶絳蟲(Taeniahydatigena，T.h)及犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis，T.c)蟲株均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。多房棘球蚴和E.m臨床樣本(鼠肝包囊、狐貍腸道寄生蟲體)由本實(shí)驗(yàn)室在伊犁昭蘇縣采集，樣本詳細(xì)信息見表1。

表1 臨床樣本信息

1.2 主要試劑瓊脂糖；2×SuperReal PreMix(Probe)；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)；GoldenViewTM核酸染料；DL2000 DNA Marker；2×Taq PCR MasterMix；Taq DNA聚合酶；pMD19-T載體；膠回收試劑盒；質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購自北京天根科技有限公司。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成針對E.mNADH3基因保守區(qū)，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針：Em-F：5′-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3′；Em-R：5′-CCAGA-ATTAAAAAAATAAATAAC-3′；Em-P：5′-(VIC)ATTTTGACTCATATATCTAATGTTGCGAAGAGCT(TAMRA)-3′，并由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備E.m陽性樣本提取DNA后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段并與pMD19-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)，篩選陽性菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定、測序及序列分析，根據(jù)序列分析結(jié)果選擇正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，測定重組質(zhì)粒的濃度，并換算成拷貝數(shù)。

1.5 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化通過矩陣法篩選反應(yīng)體系中引物和探針的最適濃度組合，并確定PCR反應(yīng)的退火-延伸溫度、反應(yīng)時(shí)間及循環(huán)數(shù)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn)將計(jì)算出拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到109～100拷貝/μL共10個稀釋度的質(zhì)粒模板，每個稀釋度做3個復(fù)孔，建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定該方法的最低檢出限。

1.7 特異性試驗(yàn)按照建立的熒光定量PCR檢測方法對提取的E.m、E.g、C.c、M.m、C.t、T.h及T.c陽性樣本DNA進(jìn)行檢測，判定該方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)選取107～103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)檢測，比較同一濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品在重復(fù)檢測中的擴(kuò)增曲線與Ct值之間有無明顯差異并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，確定該方法的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣本的檢測應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法[12]對從伊犁昭蘇縣采集的50份疑似感染多房棘球蚴或E.m的臨床樣本(表1)進(jìn)行檢測，比較兩者的敏感性和符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到長度約為189 bp的目的片段(圖1)，測序比對后確定為多房棘球絳蟲NADH3基因，表明標(biāo)準(zhǔn)陽性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD19-T-Em，質(zhì)粒質(zhì)量濃度經(jīng)測定為132 mg/L。

M.DL2000 DNA Marker；1.重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

2.2 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化結(jié)果優(yōu)化后，確定最佳反應(yīng)體系為(20.00 μL)：2×SuperReal PreMix(Probe)10.00 μL，上、下游引物(10.00 μmoL)各0.50 μL，探針(10 μmoL)0.25 μL，模板DNA 1.00 μL，滅菌ddH2O 7.75 μL。最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性試驗(yàn)結(jié)果以109～100拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動力學(xué)曲線(圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)?？梢钥闯鼋⒌姆椒梢詸z測出的標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為10 拷貝/μL，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明建立的方法靈敏度高、誤差小。

1～10.109～100 拷貝/μL；11.陰性對照

圖3 E.m實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果以E.m、E.g、C.c、M.m、C.t、T.h及T.c陽性樣本DNA為模板，分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，只有多房棘球蚴和E.m出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線(圖4)，表明建立的方法特異性較好。

1.多房棘球蚴；2.E.m標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(107 拷貝/μL)；3.多房棘球絳蟲；4.細(xì)粒棘球蚴；5.細(xì)粒棘球絳蟲；6.腦多頭蚴；7.多頭多頭絳蟲；8.細(xì)頸囊尾蚴；9.泡狀帶絳蟲；10.犬弓首蛔蟲；11.陰性對照

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用107～103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，變異系數(shù)均小于3%(表2)，表明建立的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果對采集自伊犁昭蘇縣的50份疑似感染多房棘球蚴或E.m的臨床樣本(表1)分別用熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測，熒光定量PCR檢測的陽性率為18%(9/50)，常規(guī)PCR為14%(7/50)，兩者陽性符合率為100%。

3 討論

AE為自然疫源性疾病，野生動物參與其循環(huán)鏈。在中國境內(nèi)傳播該病的中間宿主主要包括部分鼠類在內(nèi)的小型哺乳動物，終末宿主有狼、狐貍、犬等[5]，傳播宿主種類較為復(fù)雜。AE感染潛伏期長，從感染至發(fā)病一般為10～15年[2]，現(xiàn)有診斷技術(shù)還不足以發(fā)現(xiàn)早期感染[13]，而常用的組織形態(tài)學(xué)、影像學(xué)及血清免疫學(xué)在有些情況很難區(qū)分是否為AE感染，分子生物學(xué)檢測則解決了這一問題[14]?？蒲腥藛T經(jīng)過多年的不斷探索，已將基因擴(kuò)增和核酸雜交技術(shù)用于包蟲病病原的檢測，方法主要包括Southern雜交(Southern blot)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、PCR+限制性片段長度多態(tài)性(PCR+RFLP)、實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等[15-20]。Real-time PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種對模板進(jìn)行定量分析的PCR技術(shù)，以其敏感特異、快速高效等突出特點(diǎn)，可用于E.m的流行病學(xué)調(diào)查[21]。目前熒光定量PCR方法主要包括染料法(如：SYBR Green染料)和探針法(如TaqMan和MGB探針等)，雖然染料法成本比探針法低，但探針法特異性好，在臨床檢測中有著突出優(yōu)勢[22-23]。

因此，本研究基于E.mNADH3基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，建立了用于檢測該病的熒光定量PCR方法。該方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，在109～101拷貝/μL相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998，靈敏度達(dá)10拷貝/μL，與其他病原(E.g、C.c、M.m、C.t、T.h、T.c)不存在交叉反應(yīng)，組內(nèi)和組間變異系數(shù)較小(<3%)，說明該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。在臨床樣品檢測試驗(yàn)中，能成功地檢測出E.m，且與普通PCR方法相比，檢出率明顯提高，檢測時(shí)間明顯縮短，說明本研究建立的方法可以對AE病原進(jìn)行檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，對該病的防控具有重要意義。