山羊偽結(jié)核棒狀桿菌LY20株分離鑒定及病理組織學(xué)觀察

王銳鴻，林 昶，池雪林，陳仕龍，曾顯成*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350012)

偽結(jié)核棒狀桿菌感染是由偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis，CP)引起山羊、綿羊、牛、駱駝、兔等多種動物和人的體表、內(nèi)臟器官發(fā)生干酪性淋巴結(jié)炎為主要特征的一種人獸共患慢性傳染病，也是世界上公認(rèn)的難以治愈的傳染病之一[1-3]。本病對小反芻動物山羊和綿羊危害最大，發(fā)病率7%～50%[4-5]，病羊以成年羊只為主，表現(xiàn)為食欲減退、逐漸消瘦、生產(chǎn)性能下降、泌乳與繁殖功能障礙、產(chǎn)死胎、畸型胎，嚴(yán)重者甚至死亡。根據(jù)偽結(jié)核棒狀桿菌感染部位不同，臨床上分為體表型、內(nèi)臟型和混合型等3種類型，其中體表型最為普遍，常表現(xiàn)為頜下淋巴結(jié)、腮腺淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)和股前淋巴結(jié)等淺表淋巴結(jié)腫大，破潰后流出灰白色或淡黃色稠狀膿液，無臭味。偽結(jié)核棒狀桿菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，對外界環(huán)境抵抗能力強(qiáng)，容易造成持續(xù)性感染，市場上還沒有可用的疫苗，藥物治療效果不理想，一旦侵入羊群，很難徹底根除[6]。據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)統(tǒng)計，該病至少已在美洲、非洲、亞洲、歐洲和大洋洲中的64個國家中存在[4]。目前，我國云南、四川、陜西、安徽、廣西等地區(qū)均有報道[7-11]，并呈逐漸增多的趨勢，對養(yǎng)羊生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究采集福建某羊場臨床表現(xiàn)皮膚膿腫山羊的膿液，進(jìn)行細(xì)菌分離、形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察，生理生化特性及16S rRNA PCR鑒定，確定病原菌為CP，同時對分離菌進(jìn)行毒力基因檢測、藥敏試驗及病理組織學(xué)觀察，為該病的防控及致病機(jī)理研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源無菌采集福建某山羊養(yǎng)殖場臨床上表現(xiàn)皮膚膿腫疑似感染羊CP的患病羊膿液樣品，在冷藏條件下及時送實驗室做細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定。

1.2 主要試驗試劑及儀器DL2000 DNA Marker、rTaq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。血瓊脂基礎(chǔ)、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、生化微量鑒定管、藥敏紙片均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。胎牛血清(HyClone)購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司。高純DNA提取試劑盒購自羅氏公司(Roche)?？焖俜ǜ锾m染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。普通梯度PCR儀(CF-F9677)購自卡尤迪生物科技(北京)有限公司。電泳電源(power600)購自北京百晶生物技術(shù)有限公司。凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon-3500)購自上海天能科技有限公司。石蠟切片機(jī)(RM2235)和光學(xué)顯微拍照系統(tǒng)(LEICA ICC50 W)購自德國徠卡微系統(tǒng)有限公司。

1.3 實驗動物5～6周齡清潔級ICR小鼠，體質(zhì)量(25.0±0.3) g，購自福州吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司。采血制作血瓊脂平板的健康成年兔2～3 kg，購自本校派尼爾兔園。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察從采集的膿液中分離細(xì)菌，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板和鮮血瓊脂平板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察生長情況及菌落特征。挑取單個菌落接種含5%胎牛血清的營養(yǎng)肉湯進(jìn)行細(xì)菌增殖傳代培養(yǎng)，將純化后的菌體用30%緩沖甘油和冷凍干燥保存。用膿液及純化后的菌液制作細(xì)菌涂片、染色及形態(tài)觀察。

1.5 細(xì)菌生化鑒定采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對純化培養(yǎng)后的分離菌進(jìn)行生化鑒定，具體操作方法參考試劑說明書，接種后的生化管置37℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.6 藥敏試驗采用K-B紙片擴(kuò)散法對分離菌進(jìn)行藥敏試驗，操作方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)藥敏紙片說明書進(jìn)行。具體步驟為：在超凈工作臺中，用無菌棉棒將培養(yǎng)至0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木壕鶆虻耐坎荚诤?%胎牛血清的營養(yǎng)瓊脂平板上，貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑判定試驗結(jié)果。

1.7 16S rRNA擴(kuò)增及序列分析收集培養(yǎng)24 h的菌液進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，先用細(xì)菌16S rRNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1 492R：CGGYTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序及序列比對。參考GenBank羊CP(登錄號：CP024995)設(shè)計2對分段擴(kuò)增16S rRNA全長引物：16S-1(1 269 bp)，上游：GGCGTTGTTATGGTGCTGAT,下游：TGTCAAGCCCA-GGTAAGGTTC；16S-2(1 087 bp)，上游： AGG-CGATACGGGCATAACTT，下游：CAACAAACAACACTTCCCACAAT。反應(yīng)體系為25.00 μL：10×PCR buffer 2.50 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L)2.00 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL，rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA 模板1.00 μL，用滅菌超純水補(bǔ)至25.00 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃，50 s，退火57℃，30 s，延伸72℃，50 s，做35個循環(huán)；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。將鑒定后的PCR產(chǎn)物送福州尚亞生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI比對分析，用DNAStar、MEGA 5.2等生物信息學(xué)軟件組裝及分析序列，并構(gòu)建分子遺傳樹。

1.8 毒力因子檢測參考GenBank公布的CP毒力因子基因序列，分別設(shè)計PLD、Nan-H、FagA、FagB、FagC、FagD、OppA、OppB、OppC、OppD、OppF共11個毒力因子引物(表1)，引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件均參考16S rRNA擴(kuò)增方法。

表1 CP毒力因子PCR擴(kuò)增引物

1.9 動物致病性試驗挑取單菌落接種含血清的營養(yǎng)肉湯，收集培養(yǎng)24 h的菌液，根據(jù)平板計數(shù)法算出細(xì)菌的菌落形成單位(colony-forming units，CFU)，用生理鹽水將菌液濃度調(diào)整為4.4×108CFU/mL。試驗組12只小鼠，腹腔和皮下分別接種6只，接種量為0.2 mL/只；對照組12只小鼠用等量生理鹽水分別腹腔和皮下接種，每組各6只。同等條件下飼養(yǎng)，觀察及記錄小鼠情況，及時剖檢死亡小鼠，取材固定制作病理切片。

1.10 病理切片制作及觀察取出經(jīng)10%甲醛固定液固定48 h的組織標(biāo)本，放入脫水筐用流水沖洗30 h，將組織標(biāo)本修成適合大小，經(jīng)自動脫水機(jī)酒精梯度脫水，二甲苯透明、浸蠟，包埋機(jī)包埋，石蠟切片機(jī)切成5 μm的薄片，蘇木精-伊紅染色(HE)，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病變。

2 結(jié)果

2.1 臨床病變患病山羊被毛粗亂、精神沉郁、食欲減退、體質(zhì)量下降，耳根部及后肢前方體表皮下可見卵圓形大小的膿腫(圖1A)，前期觸摸較堅硬，隨著時間延長，逐漸變軟，破潰后排出大量淡黃色糊狀膿汁(圖1B)。

A.病羊右側(cè)后肢上方出現(xiàn)膿包；B.病羊耳根部膿包破潰

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察分離菌在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，普通瓊脂平板生長貧瘠，鮮血瓊脂平板可見圓形、表面光滑、易推動的乳白色菌落(圖2A、B)；含血清的營養(yǎng)肉湯靜置培養(yǎng)呈均勻混濁，管底出現(xiàn)白色沉淀(圖2C)，搖晃后可見絮狀、顆粒狀混濁(圖2D)，液體表面有一層白色菌膜(圖2E)，并將分離菌命名為LY20株。用臨床膿液和肉湯培養(yǎng)菌液制作涂片(圖3)后革蘭染色、油鏡觀察，可見革蘭陽性菌，單個散在、“V”字形或簇狀排列，呈不透明的棒狀或球桿狀。

A.血瓊脂平板生長表現(xiàn)；B.血瓊脂平板菌落顯微觀察 (×5)；C～E.分離菌在營養(yǎng)肉湯生長出現(xiàn)絮狀沉淀及白色菌膜

A.山羊臨床病例膿汁涂片染色鏡檢；B.分離菌菌液涂片染色鏡檢

2.3 細(xì)菌生化試驗分離細(xì)菌能分解葡萄糖，不分解乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖；西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原試驗、甲基紅(MR)試驗和V-P試驗結(jié)果呈陰性，尿素試驗呈陽性。參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果與偽結(jié)核棒狀桿菌相符。

2.4 16S rRNA PCR鑒定及序列分析提取分離菌DNA，用16S rRNA通用引物及分段擴(kuò)增偽結(jié)核棒狀桿菌16S rRNA全長的2對引物(16S-1和16S-2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，可見在1 504,1 269和1 087 bp 大小處均有1條明亮的特異性條帶(圖4)。將鑒定后的PCR產(chǎn)物送生物公司進(jìn)行測序，組裝得到分離菌16S rRNA全長為1 528 bp，提交NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果與CP同源性最高。用分離菌16S rRNA全長及GenBank中公布17條參考序列構(gòu)建分子遺傳進(jìn)行樹(圖5)，HEY+G模式，最大似然法，1 000次重復(fù)計算，結(jié)果CP、白喉棒狀桿菌和腎棒狀桿菌形成3個獨(dú)立分支，而分離菌聚在CP分支，親緣性最近。同源性分析顯示，分離菌與CP同源性為99.9%～100.0%，而與同屬的白喉棒狀桿菌和腎棒狀桿菌同源性分別為97.2%和95.2%。

M.DL2000 DNA Marker；1.16S rRNA通用引物；2.16S-1；3.16S-2

圖5 分離菌16S rRNA基因序列進(jìn)化樹分析

2.5 毒力基因檢測及進(jìn)化樹分析用設(shè)計的11對CP毒力基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均出現(xiàn)單一的目標(biāo)條帶(圖6)。選取毒力因子PLD進(jìn)行全基因擴(kuò)增，測序組裝后獲得PLD基因全長924 bp，GC含量47.8%，編碼307個氨基酸，相對分子質(zhì)量為33.9 kDa。采用Mega5.2軟件，最大似然法K2模式下構(gòu)建PLD核苷酸進(jìn)化樹分析(圖7)，結(jié)果CP分成羊型和馬型2個獨(dú)立分支，本次分離菌與羊型聚在同一分支，親緣性最近，與另一個分支馬型CP親緣性較遠(yuǎn)。核苷酸和氨基酸同源性比較顯示，分離菌與羊型CP同源性分別為99.9% 和99.7%，與馬型CP的同源性分別為98.1%～98.2%和97.4%。

M.DL2000 DNA Marker；1.PLD(608 bp)；2.PLD-all(1 308 bp)；3.NanH(568 bp)；4.FagA(757 bp)；5.FagB(492 bp)；6.FagC(427 bp)；7.FagD(370 bp)；8.OppA(744 bp)；9.OppB(387 bp)；10.OppC(491 bp)；11.OppD(817 bp)；12.OppF(455 bp)

圖7 CP PLD基因核苷酸進(jìn)化樹分析

2.6 動物接種試驗小鼠腹腔接種分離菌后，表現(xiàn)打堆、精神萎靡，48 h內(nèi)病死率100.0%，剖檢后肉眼可見十二指腸擴(kuò)大，充滿液體，呈透明狀；直腸膨大、表面通紅、出血；肝臟、肺臟出血或淤血。皮下接種小鼠96 h后，可見接種部位隆起、化膿，破潰后形成結(jié)痂(圖8A)，打開結(jié)痂流出濃稠淡黃色膿液(圖8B)。正常對照小鼠表現(xiàn)正常。

A.接種部位出現(xiàn)化膿、結(jié)痂；B.皮下出現(xiàn)化膿灶

2.7 病理組織學(xué)觀察小鼠感染分離菌死后迅速取材制作病理切片，光鏡下觀察可見肝臟淤血(圖9A)；脾臟組織(圖9B)白髓可見較多淋巴細(xì)胞壞死(黑色箭頭)，胞核固縮、碎裂、消失，有的與周圍組織邊界較模糊(藍(lán)色箭頭)，紅髓可見較多髓外造血灶；肺臟組織(圖9C、D)肺泡間質(zhì)可見大量中性粒細(xì)胞浸潤(綠色箭頭)，大量肺泡壁毛細(xì)血管和血管充血(藍(lán)色箭頭)，多見血管腔中炎性栓子(黑色箭頭)，有的血管結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)構(gòu)不清，局部肺泡腔可見滲出的水腫液，輕度出血(藍(lán)色箭頭)。腎臟組織(圖9E、F)被膜可見大量的疑似藍(lán)紫色細(xì)顆粒的菌團(tuán)(黑色箭頭)，腎小管排列緊密，髓質(zhì)可見個別腎小管上皮細(xì)胞壞死(藍(lán)色箭頭)，胞核固縮。十二指腸(圖9G、H)絨毛數(shù)量明顯減少，殘留的腸絨毛變短、變鈍，相互融合，腸絨毛上皮脫落(黑色箭頭)，固有層裸露，可見少量淋巴-漿細(xì)胞浸潤(綠色箭頭)；固有層腺體數(shù)量豐富，較多腸腺底部潘氏細(xì)胞減少(藍(lán)色箭頭)，腸腔可見較多脫落的腸組織。直腸組織(圖9I、J)可見較多腸上皮細(xì)胞脫落(黑色箭頭)；固有層腺體數(shù)量輕度減少，杯狀細(xì)胞大量減少，間隙變大，間質(zhì)可見少量滲出的纖維素(藍(lán)色箭頭)，伴少量的淋巴細(xì)胞浸潤(黃色箭頭)，大量間質(zhì)可見明顯出血(紅色箭頭)；黏膜下層嚴(yán)重水腫；腸腔可見大量出血性壞死物。皮膚組織(圖9K、L)表現(xiàn)化膿壞死性肌炎；肌細(xì)胞數(shù)量大量減少，溶解、壞死(藍(lán)色箭頭)，肉芽組織增生修復(fù)(黑色箭頭)，可見大量增生成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管，伴大量中性粒細(xì)胞浸潤(綠色箭頭)。

A.肝臟(×40)；B.脾臟(×20)；C～D.肺臟(×20)；E～F.腎臟(×20)；G.十二指腸(×5)；H.十二指腸(×20)；I.直腸(×5)；J.直腸(×20)；K.皮膚(×2)；L.皮膚(×20)

2.8 藥敏試驗采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗，檢測了分離菌對41種常用藥物的敏感性(圖10)，結(jié)果表明，分離菌對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、紅霉素、美羅培南、哌拉西啉/他唑巴坦、強(qiáng)力霉素、氯霉素、亞胺培南、克拉霉素等28種藥物敏感；對阿奇霉素和鏈霉素等6種藥物表現(xiàn)中介；對阿米卡星、卡那霉素、多黏菌素B等7種藥物耐藥。

1.阿奇霉素；2.甲氧嘧啶；3.鏈霉素；4.林可霉素；5.慶大霉素；6.頭孢他啶；7.阿米卡星；8.氨曲南；9.多黏菌素B；10.呋喃唑酮；11.磺胺異惡唑；12.卡那霉素；13.荼啶酸；14.阿莫西林；15.阿莫西林/棒酸；16.氨芐西林/棒酸；17.氨芐西林/舒巴坦；18.恩諾沙星；19.氟羅沙星；20.復(fù)方新諾明；21紅霉素；22.環(huán)丙沙星；23.克拉霉素；24.洛美沙星；25.氯霉素；26.美羅培南；27.米諾環(huán)素；28.奈替米星；29.諾氟沙星；30.哌拉西啉/他唑巴坦；31.強(qiáng)力霉素；32.四環(huán)素；33.頭孢克洛；34.頭孢克肟；35.頭孢哌酮/舒巴坦；36.頭孢曲松；37.頭孢噻肟；38.頭孢西叮；39.頭孢唑啉；40.亞胺培南；41.乙酰螺旋霉素；*判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)抑菌圈直徑≥S值，敏感；(2)抑菌圈直徑≤R值，耐藥；(3)R值<抑菌圈直徑

3 討論

CP是一種革蘭陽性、兼性胞內(nèi)寄生菌，是導(dǎo)致山羊干酪性淋巴結(jié)炎的重要病原菌。本菌是法國細(xì)菌學(xué)家Nocard于1888年首次從牛淋巴管炎分離得到，現(xiàn)已在世界許多地區(qū)的山羊養(yǎng)殖場中廣泛流行，嚴(yán)重影響了羊肉、羊奶和羊毛的品質(zhì)和產(chǎn)量[3,12]，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。NABIH等[13]從177只處于哺乳中后期奶山羊中采集了336份奶樣，其中24份樣品中分離出CP，檢出率為7.14%。許國洋等[14]利用多重PCR方法檢測臨床采集的80個山羊膿液樣本，結(jié)果CP單一感染的檢出率為68.80%，與其他細(xì)菌混合感染總檢率高達(dá)92.50%。KOMALA等[15]采用瓊脂凝膠沉淀試驗(AGPT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法，調(diào)查了8個農(nóng)場579只綿羊和山羊干酪性淋巴結(jié)炎的感染狀況，結(jié)果檢出陽性36例，感染率為17%。本試驗從福建某山羊養(yǎng)殖場患皮膚膿腫的山羊膿液中分離到1株細(xì)菌，該菌在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)24 h后，菌落呈乳白色、易被推動且瓊脂表面不留痕跡，沾有菌落的接種環(huán)用酒精燈火焰灼燒時發(fā)出絲絲聲音，并向四處飛濺，主要是CP細(xì)胞壁中含有較多脂類的緣故。16S rRNA分子遺傳進(jìn)化樹顯示，分離菌聚在偽結(jié)核棒狀桿菌分支，親緣性最近，同源性達(dá)99.9%～100.0%，而與同屬的白喉棒狀桿菌和腎棒狀桿菌同源性分別為97.2%和95.2%，從分子生物學(xué)方面證明分離菌為偽結(jié)核棒狀桿菌。張斯旂等[16]、許國洋等[14]對山羊皮下膿腫病原鑒定，結(jié)果表明CP、金黃色葡萄球菌及化膿隱秘桿菌是3種最主要的病原菌。由于臨床上引起山羊皮膚膿腫的病原較為復(fù)雜，且常混合感染，僅憑臨床經(jīng)驗難以鑒別，確診需借助實驗室進(jìn)行。藥敏結(jié)果可知，分離菌對環(huán)丙沙星、四環(huán)素等28種藥物敏感，對阿米卡星、卡那霉素、多黏菌素B等7種藥物耐藥，表明分離菌已產(chǎn)生耐藥。

分離菌感染小鼠病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，脾臟組織白髓有較多淋巴細(xì)胞壞死，紅髓有髓外造血灶，這表明病原菌已侵害到機(jī)體的免疫器官，同時判斷動物機(jī)體可能出現(xiàn)嚴(yán)重缺血狀態(tài)，產(chǎn)生紅細(xì)胞、粒細(xì)胞及血小板，需要恢復(fù)髓外造血功能，目前還未見到相關(guān)報道。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心，一旦遭到病原菌的破壞，就會嚴(yán)重影響其免疫調(diào)節(jié)功能。十二指腸、直腸上皮細(xì)胞脫落、壞死、出血、淋巴細(xì)胞浸潤，表明病原菌能夠損傷消化系統(tǒng)。本試驗內(nèi)臟器官病理變化主要表現(xiàn)為充血、出血、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤，沒有觀察到內(nèi)臟器官的化膿病灶，這可能與小鼠腹腔接種后急性死亡有關(guān)。皮膚組織可見化膿壞死性肌炎、肉芽組織增生，這與潘淑惠等[17]、蘭宇等[18]用CP人工皮下接種山羊和家兔所描述的臨床及病理變化相一致。由于CP感染后能在皮膚表面形成一層厚而致密的肉芽腫包囊，這也是導(dǎo)致在臨床上用藥效果不佳、難以防治此病的重要原因。

CP的致病力與其毒力因子密切相關(guān)，目前已知的毒力因子主要包括：磷脂酶D(PLD)、分枝菌酸、σ因子、寡肽透過酶(OppA、OppB、OppC、OppD和OppF)和與鐵攝取和調(diào)節(jié)相關(guān)毒力因子(FagA、FagB、FagC和FagD)，另外還有假定毒力因子：小菌毛蛋白(SpaC)、神經(jīng)氨酸酶或唾液酸酶(NanH)、真核樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶G(PknG)以及分泌銅鋅依賴的超氧化物歧化酶(SodC)[19]。其中PLD是CP中最主要的毒力因子[20]，它分泌磷脂酶D可以催化細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解[21]，從而增加血管的通透性，導(dǎo)致血漿從血管滲出進(jìn)入周圍組織，有助于細(xì)菌從感染的初始部位擴(kuò)散到淋巴結(jié)[22-23]，此外，PLD具有細(xì)胞毒性能導(dǎo)致皮膚壞死[24]。MCNAMARA等[25]研究表明使PLD基因失活時，能顯著減少山羊臨床發(fā)生淋巴結(jié)膿腫和干酪性淋巴結(jié)炎。本研究檢測分離菌毒力因子情況，結(jié)果檢測到PLD、NanH、FagA、FagB、FagC、FagD、OppA、OppB、OppC、OppD和OppF共11個毒力因子。其中FagA、FagB、FagC和FagD位于PLD下游，參與鐵的攝取，有利于CP在宿主體內(nèi)持續(xù)性感染，敲除Fag基因后，病毒毒力降低[26]。FU等[27]通過高通量測序?qū)P感染山羊脾臟組織的基因表達(dá)差異分析，認(rèn)為該菌可以進(jìn)化出一種獲得鐵的機(jī)制，這種機(jī)制能促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的生存，實現(xiàn)免疫逃逸。由于棒狀桿菌屬細(xì)菌中只有CP和潰瘍棒狀桿菌能產(chǎn)生PLD，因此，構(gòu)建PLD核苷酸進(jìn)化樹選用潰瘍棒狀桿菌做外源基因，結(jié)果顯示CP分成羊型和馬型2個獨(dú)立分支，分離菌與羊型分支菌株同源性為99.9%，而與馬型分支菌株同源性為98.1%～98.2%。研究表明，分離菌攜帶多個毒力基因，進(jìn)一步驗證了該菌具有較強(qiáng)的致病力，且可以根據(jù)PLD基因分子遺傳來推測宿主的來源。