E.tenella胞內(nèi)生殖前期對宿主細胞的損傷作用

呂曉玲，趙素芬，2，鄭明學(xué)*，王運盛，2，張 黎

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.北京市動物園，北京 100044 )

柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella,E.tenella)為已知9種雞球蟲中致病力最強、危害性最大的一種，雞感染后表現(xiàn)出精神萎靡、食欲不振、生長受阻、便血等癥狀[1-3]。E.tenella蟲體進入盲腸黏膜上皮細胞后迅速發(fā)展成為裂殖體，裂殖體成熟后會向其釋放大量的裂殖子從而損傷盲腸上皮細胞，使得黏膜上皮細胞迅速發(fā)生變性、壞死、崩解和脫落[4-5]。目前，E.tenella子孢子在胞內(nèi)生殖前期是否對宿主細胞有損傷作用尚不明確。雞盲腸上皮細胞為E.tenella天然宿主細胞，故本試驗在E.tenella感染原代雞胚盲腸上皮細胞模型的基礎(chǔ)上，通過觀測細胞形態(tài)、細胞骨架、細胞活性等方法明確E.tenella胞內(nèi)生殖前期對宿主細胞的損傷作用，該結(jié)果將為探究宿主如何對抗E.tenella感染提供新的思路，并為進一步揭示E.tenella致宿主細胞損傷的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與動物15日齡SPF雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；柔嫩艾美耳球蟲山西分離強毒株(EtSX01)孢子化卵囊，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；嗜熱菌蛋白酶、β-actin antibody購自Sigma公司；胎牛血清購自TBD公司；beta Tubulin Loading Control Monoclonal Antibody購自Invitrogen公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色液購自邁新科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 原代雞胚盲腸上皮細胞分離培養(yǎng)將15日齡SPF雞胚置于無菌工作臺中，取出并充分洗滌盲腸，將其剪成1 mm3左右的組織塊；洗滌后，組織塊用嗜熱菌蛋白酶重懸并混勻，37℃振蕩消化2 h；用PBS終止消化，用吸管輕輕吹散，吸取上清液，1 200 r/min離心5 min，棄去液體,用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于細胞瓶，培養(yǎng)70 min；收集上清，1 200 r/min離心5 min，用含2.5%FBS的原代細胞培養(yǎng)基重懸沉淀,將細胞接種于含有細胞爬片的細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行培養(yǎng),細胞貼壁率達85%時可用于后續(xù)試驗。

1.4E.tenella子孢子制備取適量E.tenella孢子化卵囊，2 000 r/min離心5 min，棄上清；將卵囊懸浮于PBS中，物理研磨脫囊率達80%時，1 800 r/min離心5 min；沉淀中加入適量孢子囊消化液，41℃、150 r/min振蕩消化，直至80%的子孢子被釋放出來；過濾后，3 000 r/min離心10 min，DMEM培養(yǎng)基懸浮沉淀，備用。

1.5 HE染色將子孢子接種于原代雞胚盲腸上皮細胞中(48孔板爬片，子孢子10萬/孔)，同時設(shè)立對照組，于不同時間點取出細胞爬片，布安氏液固定爬片細胞5 min；固定后用90%乙醇洗滌細胞，再依次在80%，70%乙醇中各浸泡1 min，然后在70%乙醇中浸泡30 min，使細胞中苦味酸的黃顏色消失；蒸餾水浸泡1 min，蘇木精染色8 min，水洗，爬片在70%，80%，90%，100%乙醇中各浸泡2 min；伊紅染色3 min，于80%，90%乙醇中各浸泡10 s，100%乙醇中浸泡1 min，二甲苯中浸泡5 min，中性樹膠封片。隨機觀察每個爬片中100個細胞的形態(tài)，并用使用14.0 MP數(shù)碼顯微鏡相機捕獲圖像。

1.6 透射電子顯微鏡觀察將子孢子接種于原代雞胚盲腸上皮細胞中(25 cm2培養(yǎng)瓶，100萬/瓶)，同時設(shè)立對照組，于不同時間點收集細胞；細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞團塊，2.5%戊二醛固定2 h；洗滌，1%鋨酸固定3 h；洗滌，30%，50%，70%，85%，95%，100%酒精Ⅰ、Ⅱ 酒精脫水，乙酸異戊酯中浸泡20 min；包埋、聚合、切片、染色，透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)并捕獲圖像。

1.7 免疫組化染色將子孢子接種于原代雞胚盲腸上皮細胞中(48孔板爬片，子孢子10萬/孔)，同時設(shè)立對照組，于不同時間點取出細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min；PBS洗滌，0.2% TritonX-100透膜5 min；PBS洗滌，3% H2O2處理5 min；PBS洗滌，山羊血清37℃封閉1 h；PBS洗滌，β-actin單克隆抗體(1∶100)、Tubulin-Beta單克隆抗體(1∶100)稀釋后分別4℃孵育過夜；PBS洗滌，HRP-羊抗兔IgG多抗(1∶200)37℃孵育1 h；PBS洗滌，按DAB試劑盒操作步驟顯色；蘇木精復(fù)染，水洗返藍，50%，70%，80%，90%，100%酒精Ⅰ、Ⅱ梯度脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，在通風(fēng)櫥中用中性樹膠封片。隨機觀察每個爬片中100個細胞細胞骨架的變化，并用使用14.0 MP數(shù)碼顯微鏡相機捕獲圖像。

1.8 MTT法檢測細胞活性將原代雞胚盲腸上皮細胞平鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后將子孢子接種于細胞中(子孢子5萬/孔)，同時設(shè)立對照組；于不同時間點加入20 μL/孔MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去營養(yǎng)液后加入150 μL DMSO溶液，于492 nm處測定D值。

1.9 乳酸脫氫酶(LDH)活性測定將原代雞胚盲腸上皮細胞平鋪于48孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后將子孢子接種于細胞中(子孢子10萬/孔)，同時設(shè)立對照組；于不同時間點吸取30 μL 細胞培養(yǎng)上清液，LDH檢測試劑盒檢測LDH活性。

2 結(jié)果

2.1E.tenella宿主細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化原代雞胚盲腸上皮細胞HE染色胞漿呈淡紅色，細胞核明顯，細胞間界限明顯(圖1A)。原代雞胚盲腸上皮細胞接種子孢子24 h時，細胞內(nèi)可見紫紅色月牙形子孢子；細胞核周圍可見納蟲空泡，但細胞形態(tài)無明顯變化(圖1B)。細胞接種子孢子48 h，子孢子發(fā)育成為橢圓形滋養(yǎng)體，H&E染色呈絳紫色，細胞形態(tài)仍無明顯變化(圖1C)。細胞接種子孢子72 h，細胞邊界不明顯，胞內(nèi)出現(xiàn)約 3 μm的裂殖子，形狀為橢圓形或圓形(圖1D)。結(jié)果表明，E.tenella胞內(nèi)生殖前期對原代雞胚盲腸上皮細胞形態(tài)無明顯影響。

A.原代雞胚盲腸上皮細胞；B.子孢子入侵24 h；C.子孢子入侵48 h；D.子孢子入侵72 h

2.2E.tenella宿主細胞細胞器的變化本試驗利用透射電子顯微鏡觀測E.tenella子孢子在胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎丑w過程中宿主細胞內(nèi)各細胞器的變化及子孢子發(fā)育過程。結(jié)果顯示，原代雞胚盲腸上皮細胞胞漿內(nèi)可觀察到多量分泌空泡，細胞器豐富且結(jié)構(gòu)正常，細胞膜表面可見微絨毛(圖2 A)。原代雞胚盲腸上皮細胞接種子孢子24 h，子孢子擠壓細胞核，胞核略凹陷，其他細胞器未見明顯變化，子孢子中可見嗜鋨酸性、無界膜、電子致密的折光體結(jié)構(gòu)(圖2 B)。細胞接種48 h，細胞內(nèi)線粒體嵴斷裂甚至消失，體積增大，膨脹呈氣球狀(圖2 C)；細胞核染色質(zhì)聚集一側(cè)，胞核濃縮，且形成凋亡小體(圖2 D)，但凋亡率與對照組細胞無明顯差異；子孢子發(fā)育成圓形的滋養(yǎng)體，折光體結(jié)構(gòu)逐漸消失，形狀變圓，核糖體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增多(圖2 E)。細胞接種72 h，細胞內(nèi)部分線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體消失，胞漿內(nèi)有大量的空泡樣結(jié)構(gòu)；滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎丑w，其內(nèi)部含有大量香蕉型的裂殖子(圖2 F)。結(jié)果表明，E.tenella胞內(nèi)生殖前期可損傷宿主細胞各細胞器。

A.原代雞胚盲腸上皮細胞(×10 000)；B.子孢子入侵24 h (×10 000)；C.子孢子入侵48 h，線粒體的變化(×10 000)；D.子孢子入侵48 h，細胞核的變化 (×10 000)；E.子孢子入侵48 h，子孢子轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)體 (×20 000)；F.子孢子入侵72 h (×10 000)

2.3E.tenella宿主細胞細胞骨架的變化本試驗利用免疫組化染色觀測E.tenella子孢子在胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榱阎丑w過程中宿主細胞細胞骨架的變化。原代雞胚盲腸上皮細胞微絲免疫組化染色均勻，呈絲狀，無聚集現(xiàn)象(圖3 A)。原代雞胚盲腸上皮細胞接種子孢子24 h，細胞微絲發(fā)生聚集，且圍繞在細胞核及蟲體周圍(圖3 B)。微管染色結(jié)果顯示：微管均勻分布于原代雞胚盲腸上皮細胞表面，呈絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3 C)；細胞接種24 h，微管聚集成團且也圍繞在蟲體周圍(圖3 D)。結(jié)果表明，E.tenella子孢子在入侵后24 h可引起細胞骨架發(fā)生重排。

A.原代雞胚盲腸上皮細胞微絲的形態(tài)；B.子孢子入侵24 h微絲的變化；C.原代雞胚盲腸上皮細胞微管的形態(tài)；D.子孢子入侵24 h微管的變化

2.4E.tenella對宿主細胞活性的影響利用MTT法檢測E.tenella子孢子入侵宿主對其細胞活性的影響，結(jié)果顯示與對照組相比，原代雞胚盲腸上皮細胞接種子孢子24 h，宿主細胞活性無明顯變化；接種48,72 h，宿主細胞的活性雖都有一定變化，但差異不顯著(表1,圖4)。結(jié)果表明，E.tenella胞內(nèi)生殖前期不影響宿主細胞活性。

表1 E.tenella子孢子入侵對細胞活性的影響 D492值

圖4 E.tenella子孢子入侵對細胞活性的影響

2.5E.tenella對宿主細胞培養(yǎng)上清LDH活性的影響細胞膜通透性增加時，胞內(nèi)LDH可釋放到細胞外[6]，因此檢測細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性可反映細胞活力。與對照組相比，原代雞胚盲腸上皮細胞接種子孢子24 h，LDH活性無明顯差異；接種48 h，LDH活性稍高于對照組，但差異不顯著；接種72 h，LDH活性高于對照組，但差異仍不顯著(表2，圖5)。結(jié)果表明，E.tenella子孢子入侵72 h內(nèi)不影響宿主細胞上清LDH的活性，證實在此過程中宿主細胞的細胞膜無明顯損傷。

表2 E.tenella子孢子入侵對宿主細胞培養(yǎng) 上清LDH活性的影響 U/L

圖5 E.tenella子孢子入侵對宿主細胞培養(yǎng)上清LDH活性的影響

3 討論

E.tenella為典型的胞內(nèi)寄生原蟲，蟲體侵入盲腸黏膜上皮細胞后經(jīng)裂殖生殖釋放裂殖子[1]。裂殖子繁殖時，盲腸會出現(xiàn)微絨毛脫落、黏膜上皮細胞腫脹、壞死、崩解等現(xiàn)象[5]。但子孢子在宿主細胞內(nèi)生殖前期是否也對細胞有損傷作用尚不清楚。本試驗結(jié)果顯示，在胞內(nèi)生殖前期，宿主細胞形態(tài)無明顯變化，但胞內(nèi)細胞器有一定程度的損傷，如線粒體腫脹且數(shù)量減少，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體消失；雖有一部分細胞會形成凋亡小體，但凋亡率與對照組細胞無明顯差異，說明子孢子胞內(nèi)生殖前期并不會引起細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，但可損傷細胞內(nèi)細胞器。

細胞骨架為病原體進入宿主細胞的第一道物理屏障，許多病毒、細菌、寄生蟲在入侵宿主細胞時均可引起微絲微管異常聚集或解聚，如豬血凝性腦脊髓炎病毒、日本乙型腦炎病毒、肺炎鏈球菌、李斯特菌、弓形蟲、隱孢子蟲等[8-12]。微絲微管的異常聚集或解聚會影響細胞蛋白質(zhì)分泌、信號傳遞等功能[13]。本試驗利用免疫組化染色觀測E.tenella入侵 24 h后微絲微管的變化,結(jié)果顯示E.tenella子孢子入侵 24 h后微絲微管發(fā)生聚集且圍繞在細胞核及蟲體周圍，證實E.tenella在入侵宿主細胞時可引起微絲微管異常聚集。但這種異常聚集是否對細胞功能產(chǎn)生影響仍需進行更深入的研究。

完整的細胞膜為細胞提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，當細胞膜受到損傷時，其通透性會發(fā)生變化，胞內(nèi)的膜性細胞器(主要為線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))也會受到損害[6]。LDH主要存在胞漿內(nèi)，基本不會釋放出來，當細胞膜通透性發(fā)生改變時可大量釋放，為細胞膜受損較為靈敏的指標之一[14]。本試驗通過測定E.tenella胞內(nèi)生殖前期宿主細胞上清液中LDH活性及細胞本身活性，以確定該期細胞膜及細胞活性的變化。試驗結(jié)果顯示，E.tenella胞內(nèi)生殖前期宿主細胞活性并無明顯變化；細胞膜完整性在48 h后，有一定程度的損傷但差異不顯著，與透射電鏡觀察到部分線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體消失的結(jié)果一致，進一步證實E.tenella胞內(nèi)生殖前期會損傷宿主細胞內(nèi)細胞器。

本試驗從細胞及胞內(nèi)細胞器形態(tài)、細胞骨架變化、細胞活性及細胞膜完整性等方面評估了E.tenella胞內(nèi)生殖前期對宿主細胞的損傷作用。結(jié)果表明，該時期E.tenella對宿主細胞有一定程度的損傷，但并不影響細胞活性，該結(jié)果為深入探究E.tenella致機體損傷機制提供研究基礎(chǔ)。