羊源土曲霉的鑒定及致病性

向 益，張 樺，王 利，魏 勇，俄木曲者，苗 斌，陳 勇

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；4.四川省巴中市南江黃羊科學(xué)研究所，四川 南江 635600)

曲霉屬(Aspergillus)是自然界中的一大類真菌，目前為止，已有300多亞種被鑒別，其中，黃曲霉、土曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等是導(dǎo)致人和動(dòng)物患侵襲性曲霉病(IA)的主要病原菌。IA是免疫功能低下患者中最常見的機(jī)會(huì)性絲狀真菌感染形式，據(jù)報(bào)道，在IA病例中，由土曲霉引起的IA已達(dá)到12.5%[1]。土曲霉是引起免疫功能低下和高?；颊吒甙l(fā)病率和高死亡率的病原菌之一。從淺表感染到嚴(yán)重侵襲性感染，土曲霉已成為機(jī)會(huì)性真菌感染的一個(gè)重要病原菌[2]。研究表明，和煙曲霉、黃曲霉相比，大多數(shù)土曲霉菌株對(duì)兩性霉素B存在耐藥性，所以土曲霉感染引起的死亡率更高[1]。土曲霉是一種機(jī)會(huì)性致病菌，通常引起人耳真菌病[3]、眼眶曲霉病[4]、灰指甲[5]、間質(zhì)性膀胱炎以及肺曲霉病[6]。除此之外，土曲霉還可引起懷孕母馬患胎盤炎而流產(chǎn)[7]、引起復(fù)發(fā)性血管肉瘤患者的顱內(nèi)土曲霉膿腫，并發(fā)張力性氣顱[8]，引起患有免疫缺陷的兒童發(fā)生肝炎[9]，同時(shí)引起外傷患者繼發(fā)椎間盤炎癥[10]。器官移植后的患者易繼發(fā)煙曲霉、黃曲霉和土曲霉感染，損傷心臟、腎臟、肺臟等組織[11]。由此可見，土曲霉除引起體表及肺部感染以外，同時(shí)也可引起動(dòng)物體各組織器官發(fā)生嚴(yán)重病理?yè)p傷。目前為止，少見有關(guān)土曲霉感染小鼠的致病性研究。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及ITS基因鑒定了1株土曲霉菌株，并進(jìn)行了小鼠感染試驗(yàn)，通過(guò)血清生化指標(biāo)、病理組織學(xué)、霉菌組織分布檢測(cè)來(lái)研究其對(duì)小鼠的致病性，以期為土曲霉病的診斷和防制提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源2019年5—6月四川某羊場(chǎng)多數(shù)湖羊出現(xiàn)精神萎靡，采食量低，腹瀉等癥狀。嚴(yán)重時(shí)，羊臥地不起，甚至死亡，懷孕母羊癱軟、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎。無(wú)菌采集病羊的心臟、肝臟組織于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 主要儀器及耗材PCR儀(S100)和凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；石蠟切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自Leica公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；AST、ALT、ALP、CREA、UREA、UA、總蛋白(TP)、GLB、ALB測(cè)定試劑盒購(gòu)自邁克生物科技有限公司；組織DNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；六胺銀染色(GMS)試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.3 菌株鑒定將接種后的PDA培養(yǎng)基28℃ 恒溫培養(yǎng)5 d后，挑取單菌落純化培養(yǎng)5 d，直接涂布鏡檢，觀察其形態(tài)特征。挑取單菌落接種于液體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，37℃，180 r/min培養(yǎng)48 h后用真菌DNA提取試劑盒提取總DNA，PCR擴(kuò)增ITS基因。真菌通用引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。 PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s；56℃退火10 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶并測(cè)序。引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，用Mega 6.0 軟件構(gòu)建ITS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 菌株毒力基因檢測(cè)以提取的MSF2菌株總DNA為模板，PCR擴(kuò)增毒力基因(引物序列見表1)。PCR擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，退火(溫度見表1)15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察。

表1 毒力基因引物序列

1.5 動(dòng)物感染試驗(yàn)20只昆明小鼠，體質(zhì)量為(18±2) g，雌雄各半，購(gòu)自四川省成都市中醫(yī)藥研究所。土曲霉無(wú)菌接種于PDA培養(yǎng)基，純化培養(yǎng)5 d 后按照文獻(xiàn)[12]的方法制備霉菌孢子懸液，并用濁度計(jì)將濃度調(diào)整為5×107CFU/mL。20只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，10只/組。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射0.3 mL孢子懸液，對(duì)照組小鼠注射同體積的生理鹽水，試驗(yàn)周期為7 d。在試驗(yàn)周期內(nèi)，觀察對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠的臨床變化，記錄試驗(yàn)組小鼠死亡情況，試驗(yàn)結(jié)束后，解剖所有小鼠，觀察其剖檢變化，取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織固定于4%多聚甲醛溶液保存，采集所有小鼠眼眶血，分離血清保存于-20℃，用于AST、ALT、TP、UREA、CREA等生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 組織ITS基因擴(kuò)增參照組織DNA提取試劑盒說(shuō)明，提取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸組織的總DNA，其濃度及質(zhì)量于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后(D260 nm/D280 nm=1.8～2.0)，于-20℃保存?zhèn)溆?。以上述提取的各組織的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增ITS基因，反應(yīng)程序同1.3。

1.7 病理組織切片GMS染色采集小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織常規(guī)脫蠟、透明、包埋，制成病理組織切片后，脫蠟至水，用GMS染色試劑盒對(duì)上述組織染色，染色后脫水、封片，風(fēng)干后于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 病理組織切片HE染色采集小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟等組織于4%多聚甲醛固定，經(jīng)流水沖洗24 h后，30%～100%乙醇逐級(jí)脫水1 h，二甲苯透明30 min，浸蠟、包埋、切片、60℃烤片，逐級(jí)脫蠟至水，蘇木素染色15 min，鹽酸分化，氨水復(fù)藍(lán)，伊紅復(fù)染2 min，再逐級(jí)乙醇脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理變化。

1.9 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel初步整理后，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Graphpad prism 5.0軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果從病羊心臟、肝臟組織分離到具有相似形態(tài)的菌落，其在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度緩慢，質(zhì)地為絨毛狀，初期為淡黃色，后期呈黃褐色，背面為淡黃色(圖1A)。直接涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)其分生孢子頭呈疏松放射狀，黑褐色色素沉積，分生孢子梗光滑、透明，有分支菌絲，分生孢子為球形(圖1B)，初步鑒定分離株為土曲霉。擴(kuò)增該分離株ITS基因得到長(zhǎng)度為595 bp的條帶(圖2A)，提交到GenBank獲得登錄號(hào)：MW412636。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)與MN429211.1Aspergillusturreus的同源性達(dá)99.81%(圖2B)。綜合鑒定該分離株為土曲霉，并命名為MSF2株。

A.MSF2菌株培養(yǎng)結(jié)果；B.MSF2菌株鏡檢結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1.ITS基因PCR產(chǎn)物

2.2 菌株毒力基因檢測(cè)MSF2菌株毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示:Alb1擴(kuò)增陽(yáng)性，大小為303 bp;Rho1陽(yáng)性，大小為220 bp;PKAR陽(yáng)性，大小為224 bp;Cat1陽(yáng)性，大小為330 bp;Alp2陽(yáng)性，大小為130 bp;AspF1陽(yáng)性，大小為201 bp(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.Alb1基因PCR產(chǎn)物；2.Rho1基因PCR產(chǎn)物；3.PKAR基因PCR產(chǎn)物；4.Cat1基因PCR產(chǎn)物；5.Alp2基因PCR產(chǎn)物；6.AspF1基因PCR產(chǎn)物

2.3 臨床癥狀及剖檢變化孢子懸液注射小鼠后2 d，小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、食欲下降、弓背、站立不穩(wěn)等臨床癥狀，攻毒5 d后開始有小鼠死亡，死亡率為30%。剖檢試驗(yàn)組小鼠發(fā)現(xiàn)其腹部積淡黃色液體，內(nèi)臟器官黏連，其腎臟、脾臟組織腫大、顏色加深；肺臟表面有大小不一出血點(diǎn)，顏色蒼白;小腸黏膜出現(xiàn)紅色血栓。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)生化檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠ALB含量降低(P<0.05)，GLB含量升高(P<0.01)，提示小鼠機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)；ALP、ALT、AST含量升高(P<0.01)，提示小鼠肝功能被損害；UREA、CREA和UA含量顯著升高(P<0.01)，提示小鼠腎功能受損(圖4)。

A.蛋白生化指標(biāo)；B.肝臟生化指標(biāo)；C.腎臟生化指標(biāo)。*.P<0.05差異顯著；**.P<0.01差異極顯著

2.5 組織ITS基因檢測(cè)提取各組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸組織DNA，PCR擴(kuò)增真菌ITS基因，試驗(yàn)組小鼠臟器均擴(kuò)增出595 bp的條帶(圖5)，經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，均為土曲霉。對(duì)照組小鼠各臟器ITS基因擴(kuò)增呈陰性。

M.DL2000 DNA Marker；1.心臟ITS基因；2.肝臟ITS基因；3.脾臟ITS基因；4.肺臟ITS基因；5.腎臟ITS基因；6.小腸ITS基因

2.6 組織GMS染色真菌GMS染色結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠的心肌細(xì)胞上出現(xiàn)被染成黑色菌絲(圖6A)；肝細(xì)胞間出現(xiàn)黑色且有分支的菌絲(圖6B)； 脾臟紅髓區(qū)出現(xiàn)被染成黑色的細(xì)小菌絲(圖6C)；肺組織中出現(xiàn)黑棕色成團(tuán)菌絲聚集(圖6D)；腎組織中出現(xiàn)被染成棕褐色、粗大、呈45°分支的菌絲(圖6E)；小腸組織間可見被染成黑色的霉菌菌絲(圖6F)。

A.心臟；B.肝臟；C.脾臟；D.肺臟；E.腎臟；F.小腸

2.7 病理組織切片觀察試驗(yàn)組小鼠病理組織切片結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞腫大，細(xì)胞核增大，胞漿內(nèi)充滿淡紅色物質(zhì)，呈玻璃樣變性(圖7A)；肝細(xì)胞腫脹變性，肝索結(jié)構(gòu)模糊，部分肝細(xì)胞壞死，肝竇擴(kuò)張、充血，中央靜脈周圍炎性細(xì)胞聚集(圖7B)；脾臟紅髓區(qū)大量紅細(xì)胞聚集，淀粉樣變性(圖7C)；肺泡擴(kuò)張、肺泡毛細(xì)血管充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡上皮細(xì)胞脫落，淡紅色纖維素性物質(zhì)滲入肺泡腔(圖7D)；腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、壞死、脫落，毛細(xì)血管充血(圖7E)；小腸部分絨毛脫落，腸腺內(nèi)有紅細(xì)胞聚集(圖7F)；上述組織中均可看見少量圓形透明孢子侵入(箭頭)。

A.心肌細(xì)胞腫大、玻璃樣變，可見透明孢子 (箭頭)；B.肝細(xì)胞腫脹變性，肝竇充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見透明孢子 (箭頭)；C.脾紅髓區(qū)充血，白髓區(qū)淀粉樣變性，少量孢子侵入(箭頭)；D.肺泡隔充血，肺泡上皮細(xì)胞脫落，有少量孢子侵入(箭頭)；E.腎小管上皮細(xì)胞變性，毛細(xì)血管充血，霉菌孢子侵入組織間(箭頭)；F.小腸絨毛脫落，黏膜可見少量透明孢子(箭頭)

3 討論

土曲霉是曲霉屬中的一種，可根據(jù)其生長(zhǎng)特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定。MORTAZ等[13]報(bào)道土曲霉A1120菌株在沙堡羅葡萄糖瓊脂上培養(yǎng)48～72 h，出現(xiàn)光滑的淡黃色粉末狀菌落，隨后變成黃褐色，鏡檢發(fā)現(xiàn)其有隔膜和透明菌絲，呈球狀或橢圓形。SINGH等[14]報(bào)道土曲霉FHM0035菌株在PDA上培養(yǎng)時(shí)，初期呈現(xiàn)黃色菌落，后期菌落顏色變暗，鏡檢發(fā)現(xiàn)其分生孢子透明、光滑，呈現(xiàn)分隔菌絲狀。KIRSCHNER等[15]報(bào)道土曲霉CK12菌株在PDA上生長(zhǎng)快速，呈淡黃色菌落，鏡檢發(fā)現(xiàn)其分生孢子較大、呈球形。本研究中，土曲霉MSF2菌株在PDA上的生長(zhǎng)特性與鏡檢的形態(tài)特征與上述結(jié)果基本一致。

曲霉屬真菌的分生孢子能通過(guò)空氣傳播并且能在各種環(huán)境中存活、生長(zhǎng)，感染人和動(dòng)物發(fā)病，主要是內(nèi)部多種毒力因子共同作用的結(jié)果[16]。分生孢子黑素(Alb1)基因與黑色素形成有關(guān)，色素可幫助真菌在環(huán)境中存活[17]。小G蛋白(Rho1)基因參與了曲霉細(xì)胞壁的形成，敲除煙曲霉Rho1后，煙曲霉幾乎不能生長(zhǎng)[16]。蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞基(PKAR)與過(guò)氧化氫酶1(Cat1)分別編碼編cAMP依賴蛋白激酶和去除ROS酶，可幫助曲霉提高入侵能力及抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷作用[18]。堿性蛋白酶(Alp2)編碼堿性絲氨酸蛋白酶，可降解彈性蛋白、膠原蛋白，與真菌營(yíng)養(yǎng)吸收、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及毒性有關(guān)[19]。核糖核酸酶(Aspf1)是核糖體毒素的一種，是煙曲霉的主要過(guò)敏原，進(jìn)入宿主后，核糖毒素通過(guò)使核糖體失活來(lái)抑制蛋白質(zhì)生物合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。TSAI等[21]從人源煙曲霉菌株中檢測(cè)到了Alb1、Rhol、PKAR、Cat1基因，證實(shí)了毒力因子在煙曲霉侵襲感染中的重要性。ALVAREZ等[20]從人源黃曲霉中檢測(cè)到了Alp2、Aspf1、Cat1基因，證實(shí)缺失這些毒力因子后會(huì)減弱黃曲霉引起的小鼠氣道炎癥反應(yīng)。ABAD等[19]從人源煙曲霉中檢測(cè)到了Alp2、Cat1毒力基因，并研究了其在煙曲霉致病機(jī)理中的重要作用。目前這些毒力因子僅在煙曲霉中有報(bào)道，本研究從土曲霉MSF2菌株擴(kuò)增出上述毒力因子，提示該菌株具有較強(qiáng)的致病性。

土曲霉通常對(duì)免疫功能低下的患者產(chǎn)生嚴(yán)重危害。KNUDTSON等[22]報(bào)道土曲霉引起牛胎盤炎并導(dǎo)致流產(chǎn)，GMS染色發(fā)現(xiàn)胎盤子葉、胎兒眼瞼部有分支、不規(guī)則菌絲，支氣管內(nèi)周圍粒細(xì)胞、纖維蛋白和巨噬細(xì)胞聚集。TRACHANA等[9]報(bào)道土曲霉感染引起免疫缺陷的兒童出現(xiàn)高熱、腹脹等癥狀，超聲檢查其肝臟腫大，活檢發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝竇嚴(yán)重充血等炎癥反應(yīng)。TAKAGI等[10]報(bào)道了受傷患者繼發(fā)土曲霉感染，引發(fā)椎間盤炎癥，組織病理學(xué)檢查顯示小梁骨之間的肉芽和肉芽腫中有大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，呈現(xiàn)慢性化膿性骨髓炎癥，并從椎骨間分離出了土曲霉菌株。SCHETT等[23]報(bào)道土曲霉引起急性淋巴細(xì)胞白血病患者由土曲霉感染而引起的心內(nèi)膜炎，尸檢發(fā)現(xiàn)其主動(dòng)脈栓塞，脾臟和腎臟腫大，PAS染色發(fā)現(xiàn)二尖瓣大量菌絲被染成紅色。目前，關(guān)于土曲霉引起小鼠組織臟器病變的研究尚少，SHARMA等[24]用土曲霉和黃曲霉混合感染大鼠，研究其肝臟的病變特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)小鼠肝臟腫大，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝竇擴(kuò)張充血、肝細(xì)胞壞死、脂肪變性、單核細(xì)胞浸潤(rùn)。SLESIONA等[25]報(bào)道土曲霉感染小鼠后引起肝臟蒼白化，肝細(xì)胞空泡化脂肪變性，肺臟中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟和腎臟沒有明顯病理變化。本研究中，土曲霉除可引起心臟、腎臟、脾臟組織發(fā)生病變，與上述結(jié)果不一致，可能與菌株來(lái)源不同或菌株毒力差異有關(guān)。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及擴(kuò)增ITS基因，鑒定MSF2菌株為土曲霉，并擴(kuò)增了毒力基因，通過(guò)小鼠感染試驗(yàn)研究了對(duì)小鼠的毒性作用，為土曲霉菌病的診斷和治療提供參考資料。