致豬腦膜炎綠色氣球菌的分離鑒定與16S rRNA基因序列遺傳進化分析

蔣增海，孫 浩，謝靜靜，王紫晗，徐耀輝,2，何啟蓋

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

綠色氣球菌(Aeroeoccusviridans)是第一個歸屬于氣球菌屬(Aeroeoccus)的一個種，為革蘭陽性，兼性厭氧型，氧化酶和接觸酶陰性的球菌[1]。該菌廣泛分布在自然界中，存在于健康人體的上呼吸道及皮膚上，是醫(yī)院的重要條件致病菌，在機體免疫力低下或免疫功能不健全時，可導(dǎo)致人發(fā)生敗血癥、菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿道感染、腦膜炎以及關(guān)節(jié)炎等[2-4]。雖然綠色氣球菌在國內(nèi)外獸醫(yī)領(lǐng)域研究較少，但是已有報道該菌與牛乳房炎相關(guān)，被認為是豬關(guān)節(jié)炎、肺炎、腦膜炎或者尿路感染的一種病原體[5-6]，且常常分離于魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動物[3]。國內(nèi)已有研究從仔豬心臟[7]、肺臟[7-9]、脾臟[10]、關(guān)節(jié)液[11]、肝臟[2]等分離到綠色氣球菌，并進行了動物回歸試驗、藥敏試驗等，但是從腦部組織分離綠色氣球菌研究較少[12]。

2020年11月中旬，天氣突然降溫，河南省豫西某規(guī)?；i場飼養(yǎng)60～70日齡仔豬，豬群密度較大，在63日齡接種豬瘟弱毒疫苗后的第5天，出現(xiàn)4頭仔豬猝死，于第7天，又發(fā)生3頭仔豬死亡，瀕臨死亡前有劃水樣的神經(jīng)癥狀，但體況良好，且這3頭病死仔豬中，有2頭病死仔豬的關(guān)節(jié)還表現(xiàn)為腫大。為了確定這些致腦炎死亡仔豬的病因，從3頭病死仔豬體內(nèi)，無菌采集病料，進行細菌分離鑒定并開展本研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源病料為送檢3頭病死仔豬的腦部組織，以及其中2頭病死仔豬腫大的關(guān)節(jié)組織。

1.2 主要試劑胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)購自美國BD公司；犢牛血清購自杭州四季青生物有限公司；哥倫比亞血瓊脂平板購自江門市凱林貿(mào)易有限公司；Ex Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、10 × Ex Taq Buffer(Mg2+plus)購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；生化試驗試劑反應(yīng)管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離培養(yǎng)從送檢3頭病死仔豬，無菌采集腦組織、關(guān)節(jié)液，分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h， 選擇形態(tài)大小均勻一致的優(yōu)勢菌落，進一步接種哥倫比亞血瓊脂平板、TSA平板(添加5%犢牛血清)進行純化、傳代，挑取單菌落，接種于TSB肉湯(添加5%犢牛血清)，37℃培養(yǎng)18～24 h，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 染色鏡檢從純化培養(yǎng)的血瓊脂平板中，挑取單菌落，進行革蘭染色后，油鏡下，觀察純培養(yǎng)物的形態(tài)特征。

1.5 生化試驗從分離純化的血瓊脂平板中，挑取單菌落，接種于TSB肉湯中，37℃培養(yǎng)16～18 h,取少量菌液接種于微量生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24～96 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA基因序列測定與遺傳進化分析通過水煮法提取細菌DNA模板，利用16S rRNA通用引物(16S-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S-1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTA-CGACTT-3′)，進行16S rRNA基因序列的PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。首先通過BLAST，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的基因序列進行同源性比對，進行分離菌株鑒定。其次，使用DNAStar.Lasergene.v7.1和MEGA 5.05軟件，將測序結(jié)果與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取相近的基因序列進行比對(表1)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 各種綠色氣球菌參考菌株的信息

1.7 藥敏試驗根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦K-B紙片擴散法適當修改，進行操作和結(jié)果判定[13-14]。挑取生長良好的綠色氣球菌單菌落，接種于TSB肉湯(5%犢牛血清)，37℃培養(yǎng)24 h 后，再將菌液稀釋為0.5麥氏濁度，使用滅菌棉簽，蘸取菌液均勻涂布于哥倫比亞血瓊脂平板，貼上藥物紙片，37℃培養(yǎng)18～24 h,測定各種藥敏片抑菌圈，根據(jù)抑菌圈測量結(jié)果，進行藥物敏感性判定[13-14]。

2 結(jié)果

2.1 病豬的主要病理變化送檢3頭仔豬，打開顱骨后，可見腦膜出血，血管怒張明顯，但是出血嚴重程度有一定差異(圖1)；其中2頭仔豬，存在膝關(guān)節(jié)腫大，切開關(guān)節(jié)，可見關(guān)節(jié)液增多。

圖1 剖檢3頭仔豬腦膜出血、血管怒張

2.2 細菌的分離培養(yǎng)特征采集病死仔豬腦組織、關(guān)節(jié)炎5份病料，分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)，純化、傳代，并接種于TSA(添加5%犢牛血清)平板培養(yǎng)，結(jié)果表明，共分離到5株細菌，分別命名為P1、P2、P3、T1和T2(P代表分離于腦，T代表分離于膝關(guān)節(jié)；其中P1、T1分別分離于同1頭豬的腦和關(guān)節(jié)，P2和T2分別分離于另外1頭豬的腦和關(guān)節(jié)，P3分離于第3頭豬的腦部)。分離菌株在血瓊脂平板上生長呈灰白色、圓形，大小為1.4～1.5 mm 的小菌落，呈草綠色的α溶血環(huán)(圖2)，相比豬鏈球菌菌落的α溶血環(huán)更大，溶血程度更明顯；分離菌株在TSA(添加5%犢牛血清)生長良好，菌落呈淡白色、圓形，大小為1.0～1.5 mm,不透明。

A.正面；B.反面

2.3 染色鏡檢特征分離菌株通過革蘭染色，油鏡下觀察，呈革蘭陽性，單個、雙聯(lián)或者四聯(lián)的球菌(圖3)。

圖3 分離菌株革蘭染色結(jié)果(×1 000)

2.4 生化試驗將5株疑似分離菌株分別接種進行生化反應(yīng)鑒定，結(jié)果表明分離菌株接觸酶試驗、氧化酶試驗均為陰性，能發(fā)酵乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、蕈糖，不能發(fā)酵棉籽糖、山梨醇、密二糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖；M.R.試驗為陽性，硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、V-P試驗結(jié)果為陰性，不能與馬尿酸、尿素、七葉苷發(fā)生反應(yīng)，鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗為陰性；不能利用枸櫞酸鹽。根據(jù)生化試驗結(jié)果，將分離菌株鑒定為綠色氣球菌。

2.5 16S rRNA基因的PCR擴增利用分離菌株提取的細菌DNA為模板，進行16S rRNA基因的PCR擴增，其擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂凝膠電泳檢測，在1 000～2 000 bp可見1條約1 500 bp清晰的目的條帶(圖4)，表明擴增的目的條帶與預(yù)期擴增結(jié)果大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.分離菌株；6.去離子水

2.6 16S rRNA基因序列測定與遺傳進化分析5株分離細菌的16S rRNA基因序列的測序結(jié)果，通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的基因序列進行同源性比對，結(jié)果表明,與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的綠色氣球菌菌株同源性在99%以上,進一步表明5株分離細菌均為綠色氣球菌。

利用DNAStar、Lasergene.v7.1軟件，將測序結(jié)果與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取相近的基因序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明分離菌株P(guān)1、T1、T2和P2單獨構(gòu)成一個獨立分支，與分離菌株P(guān)3親緣關(guān)系較遠，然而分離菌株P(guān)3與2017年中國山東分離于植物根圍的FL09菌株、2017年印度分離于新生兒血液樣品的SNSK 102菌株親緣關(guān)系最近，與2009年中國廣東分離于關(guān)節(jié)炎的GDQY-1、2018中國吉林分離于腦膜炎的AV-X1、2019年中國河北分離于關(guān)節(jié)液的HDS1等比其他4株綠色氣球菌分離菌株的親緣關(guān)系更近；5株綠色氣球菌分離菌株均與2019年法國分離于皮膚的1菌株親緣關(guān)系最遠(圖5)。

圖5 分離菌株16S rRNA基因序列遺傳進化關(guān)系

2.7 藥敏試驗結(jié)果由于目前還沒有建立起綠色氣球菌藥敏試驗的解釋標準，本試驗根據(jù)CLSI公布的鏈球菌、葡萄球菌等細菌藥敏試驗的解釋標準進行判定，研究結(jié)果表明，分離菌株對復(fù)方新諾明(磺胺類藥物)、四環(huán)素、頭孢曲松耐藥率均為100%(5/5),對氧氟沙星、頭孢噻肟、紅霉素耐藥率為80%(4/5)，對氯霉素、環(huán)丙沙星等敏感率相對較高，對其他藥物敏感性不等(表2)。

表2 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

綠色氣球菌現(xiàn)已經(jīng)被報道作為人和動物的病原菌，但是正常情況下，在臨床診斷過程中，綠色氣球菌不是調(diào)查的病原菌，通常被誤診為其他病原菌[3]，因此綠色氣球菌對人和動物的致病性，沒有得到足夠重視。綠色氣球菌作為機會病原菌，在機體抵抗力下降情況，更容易導(dǎo)致感染，經(jīng)常與其他病原菌如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)等混合感染[2-3,9]。PAN等[15]報道豬鏈球菌和綠色氣球菌混合感染，引起了仔豬急性腦炎，與本研究第3頭仔豬感染情況一致(從第3頭仔豬的腦部不僅分離到綠色球菌P3，又分離到豬鏈球菌，文中沒有顯示該數(shù)據(jù))。本研究從接種過豬瘟弱毒疫苗后第7天，發(fā)生腦膜炎致死的仔豬腦部和膝關(guān)節(jié)中分離到了綠色氣球菌，表明綠色氣球菌與豬鏈球菌一樣，可以單獨或者兩者一起引起仔豬感染，發(fā)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎，造成死亡，應(yīng)引起重視。

本研究中，分離菌株16S rRNA 基因序列，通過BlAST同源性比對，表明與綠色氣球菌的同源性最高，為99%以上，進一步證明分離菌株均為綠色氣球菌。16S rRNA基因序列遺傳進化分析表明，分離菌株P(guān)1、T1、T2和P2處于同一分支，與分離菌株P(guān)3親緣關(guān)系較遠，然而分離菌株P(guān)3與2017年中國山東分離于植物根圍的FL09菌株、2017年印度分離于新生兒血液樣品的SNSK 102菌株親緣關(guān)系最近，這說明了分離菌株P(guān)3與不同物種及地域和時間上分離的菌株差異性小，而與在同一物種同一地域分離的菌株P(guān)1、T1、T2和P2則存在一定的差異性，與張樂宜等[7]報道結(jié)果一致。

目前，雖然還沒有建立起對于綠色氣球菌藥敏試驗的折點解釋標準，但是國內(nèi)外學(xué)者都對綠色氣球菌耐藥情況進行調(diào)查研究[3,5，8-11]。MORENO等[5]研究表明對于從豬尿道感染分離到的綠色氣球菌，頭孢噻呋、氟喹諾酮類和氨基糖苷類等藥物的最低抑菌濃度顯示變異很大，磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類、卡那霉素等藥物顯示最高的最低抑菌濃度，表明可能耐藥。本研究中，分離菌株對復(fù)方新諾明、四環(huán)素均耐藥，其中4株分離菌株對紅霉素耐藥，其中3株分離菌對卡那霉素耐藥，與上述報道基本一致；分離菌株對頭孢噻呋均耐藥，與林華等[2]報道綠色氣球菌對β-內(nèi)酰胺類藥物有較好的敏感性不同；分離菌株對氯霉素、環(huán)丙沙星等相對敏感，與董文龍等[8]報道結(jié)果基本一致。雖然，分離菌株P(guān)1、T1或者P2、T2分別分離于同1頭病豬的2個不同部分，但是其藥敏試驗結(jié)果也有差異。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，可以選擇環(huán)丙沙星，或者氯霉素同類藥物氟苯尼考作為本次綠色氣球菌感染的治療藥物。

本研究結(jié)果顯示雖然分離菌株來源于同一個豬場的同一次疫情暴發(fā)，甚至來源于同一頭病豬的不同部位，但是分離菌株16S rRNA基因遺傳進化關(guān)系距離較遠，以及耐藥性存在顯著差異，表明這些綠色氣球菌分離菌株可能不是來源于同一個菌株的克隆子，存在巨大遺傳多樣性，與MARTN等[6]報道來源于同一豬群的不同病豬的綠色氣球菌存在巨大遺傳多樣性的結(jié)果一致。進一步說明綠色氣球菌是一種機會病原菌，在同一豬場中存在遺傳多樣性的不同菌株，當豬群暴露于環(huán)境中的多種綠色氣球菌菌株條件下，天氣突變、 群體密度過大、免疫接種抓捕等,作為重要誘因，能夠引起不同仔豬發(fā)病，而不是由1頭仔豬感染綠色氣球菌后，排出病菌，再次傳染給其他仔豬的流行情況。