吉林省規(guī)?；i場斷奶仔豬大腸桿菌分離鑒定與耐藥表型及耐藥基因檢測

冀亞路，姜秋杰，襲恒豫，張 昊，畢斕婷，陳椿樺，付殿國，孫長江，馮 新，顧敬敏,3*，韓文瑜,3*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062;2.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心， 吉林 長春 130062；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州225000)

仔豬腹瀉是全球養(yǎng)豬業(yè)最具挑戰(zhàn)性的疾病之一，每年都會造成巨大的經(jīng)濟損失。我國擁有世界上最大的生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，約占全世界生豬總數(shù)的50%，仔豬腹瀉年均發(fā)病率和死亡率分別高達46.5%和15.0%，直接經(jīng)濟損失高達1.45億美元[1-2]。引發(fā)仔豬腹瀉的原因復(fù)雜多樣，其中細菌性腹瀉是主要病因之一，主要病原菌有大腸桿菌、沙門菌、魏氏梭菌等。大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌的某些血清型引起的以新生和幼齡動物為主的腸道感染性疾病。斷奶仔豬患病后表現(xiàn)為仔豬黃痢、仔豬白痢及仔豬水腫等特征，發(fā)病率和死亡率較高。隨著豬養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴大，加之部分豬場生物安全體系不健全，細菌性大腸桿菌仔豬腹瀉的發(fā)病率持續(xù)升高[3-4]。

抗生素治療是臨床上治療仔豬細菌性腹瀉的主要途徑之一。此外，自發(fā)現(xiàn)抗生素對飼養(yǎng)動物具有促生長和預(yù)防疾病作用以來，抗生素作為飼料添加劑在動物養(yǎng)殖業(yè)中得到了長期廣泛地應(yīng)用和不規(guī)范使用[5]，促進大腸桿菌耐藥性的形成，使其表現(xiàn)出多重耐藥性，甚至出現(xiàn)“超級細菌”。此外，大腸桿菌是動物腸道的正常菌群，被認為是耐藥基因的儲存庫，耐藥基因可以通過大腸桿菌擴散傳播到環(huán)境中，給人類和養(yǎng)殖業(yè)造成潛在的威脅[6-14]。

2006年1月1日起，歐盟開始禁止在動物飼料中使用抗生素作為生長促進劑，荷蘭等其他國家相繼采取這一措施，以應(yīng)對日益嚴重的細菌耐藥性和抗生素殘留問題。我國于2020年7月在飼料端實行禁抗，在此背景下，細菌解除了抗生素的經(jīng)常性選擇壓力，病原菌的感染率與發(fā)病規(guī)律、耐藥性必將發(fā)生變化，給細菌性疾病的防控帶來新的挑戰(zhàn)。

為了解飼料端“禁抗”前吉林省不同地區(qū)規(guī)?；i養(yǎng)殖場內(nèi)大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀以及耐藥基因存在情況，本研究對吉林省20個市(縣)地區(qū)共35個規(guī)模化生豬養(yǎng)殖場斷奶仔豬糞便樣本進行大腸桿菌分離鑒定，并對分離菌株進行藥物敏感性測定以及耐藥基因PCR檢測，為臨床用藥、進一步研究大腸桿菌耐藥分子機制以及了解“禁抗”前吉林省大腸桿菌耐藥情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料采集2020年6—8月，于吉林省20個市(縣)35個生豬規(guī)?；B(yǎng)殖場采集斷奶仔豬糞便樣本(1 144份)，其中腹瀉仔豬(糞便成黃白痢)糞便樣本994份，健康仔豬糞便樣本150份。

1.2 主要試驗材料無菌采樣管(HBPT034-2)、無菌接種環(huán)、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基以及瓊脂糖購自青島海博生物科技有限公司；革蘭染色試劑盒購自珠海貝索生物科技有限公司；20種抗生素藥敏片(青霉素、阿莫西林、氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、強力霉素、頭孢曲松鈉、頭孢西丁、頭孢他啶、多黏菌素、磷霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑、鏈霉素、卡納霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考)購自杭州微生物試劑有限公司；Premix Tap酶(TaKaRa)購自長春海靈科貿(mào)有限公司。

1.3 糞便樣本處理及細菌分離與純化將采集的糞便樣本在新鮮LB肉湯培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)后，使用無菌接種環(huán)蘸取擴增液，劃線接種于麥康凱固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 18～24 h。待麥康凱固體培養(yǎng)基上長出單菌落，使用無菌接種環(huán)挑取紅色單菌落，劃線接種至伊紅-美藍瓊脂固體平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h。最后，挑取疑似單個菌落(黑色帶綠色金屬光澤)接種至LB營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h，-20℃保菌備用。另外，取培養(yǎng)物革蘭染色鏡檢觀察。

1.4 豬源分離菌株16S rRNA測序鑒定及生化鑒定使用“煮沸裂解法”提取純化后分離菌株的全基因組DNA，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司16S rRNA測序，測序結(jié)果于NCBI中BLAST比對，鑒定標(biāo)準按照同源性≥97%判定。同源性<97%的菌株利用微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行生化鑒定，結(jié)果見表1。

表1 豬源大腸桿菌分離菌株生化鑒定結(jié)果

1.5 豬源大腸桿菌分離株藥物敏感性測定按照細菌藥敏試紙使用說明書及K-B (Kirby-Bauer)法測定分離菌株對20種抗生素藥物敏感性。將大腸桿菌分離株在LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期(D600= 0.8)，取200 μL菌液滴于LB瓊脂平板上，使用無菌玻璃涂布棒均勻涂布菌液，待菌液晾干，將藥敏片貼在涂布有菌液的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，測量各抗生素抑菌圈直徑，按照CLSI-2017說明書判定分離菌藥物敏感性。

1.6 豬源大腸桿菌分離株耐藥基因PCR測定采用PCR方法對大腸桿菌分離株進行耐藥基因檢測。耐藥基因分別為β-內(nèi)酰胺類blaTEM、blaCTX、blaSHV，喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrS、qnrB、aac(6)-Ⅰb，氨基糖苷類耐藥基因aph(3)-Ⅱa、aac(3)-Ⅰb、ant(3)-Ⅰa、aac(3)-Ⅱb，氯霉素類耐藥基因floR，四環(huán)素類耐藥基因tetM、tetK以及磺胺類耐藥基因sulI。所有耐藥基因序列參考文獻[7-8]，利用表2中引物序列擴增目的基因序列，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。PCR總體系25.0 μL：模板DNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Premix Tap酶12.5 μL，ddH2O 11.0 μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性35 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃ 終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果序列在GenBank中比對，進一步確定耐藥基因序列并作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 豬源大腸桿菌分離與鑒定經(jīng)16S rRNA測序和生化鑒定(表2)，從1 144份糞便樣本中共分離鑒定出大腸桿菌892株，總陽性率為77.97%。其中健康糞便樣本大腸桿菌分離率為72.67%(109/150)，腹瀉糞便樣本大腸桿菌分離率78.78%(783/994)，無論健康糞便還是腹瀉糞便樣本，均出現(xiàn)很高的大腸桿菌陽性率，各豬場大腸桿菌陽性率見表3。

表2 耐藥基因PCR擴增引物序列

表3 吉林省規(guī)?；i養(yǎng)殖場大腸桿菌分離情況

2.2 豬源大腸桿菌分離株藥物敏感性測定結(jié)果對892株大腸桿菌分離株進行20種抗生素藥物敏感性測定,結(jié)果如表4、圖1所示，大腸桿菌分離菌株對β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類以及氯霉素類抗生素表現(xiàn)出高耐藥率。其中對β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素、阿莫西林、氨芐西林耐藥率分別為99.78%，81.66%，100.00%；紅霉素、四環(huán)素、強力霉素、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑耐藥率分別為91.27%，99.56%，95.41%，84.50%，98.69%；對鏈霉素、卡納霉素、慶大霉素以及氟苯尼考耐藥率分別為90.83%，70.52%，34.28%,71.83%。相比之下，對頭孢類和多磷類抗生素耐藥率較低，例如對頭孢類抗生素頭孢曲松鈉、頭孢西丁、頭孢他啶的耐藥率分別為38.86%，17.17%，28.17%，對磷霉素耐藥率僅為6.99%。此外，未發(fā)現(xiàn)多黏菌素耐藥菌株。所有大腸桿菌分離株均表現(xiàn)出3種以上抗生素耐藥性，近50%菌株對10種抗生素產(chǎn)生耐藥性，表明吉林省規(guī)?；i場大腸桿菌具有嚴重的多重耐藥性。

圖1 豬源大腸桿菌分離株抗生素耐藥率統(tǒng)計

表4 豬源大腸桿菌分離株抗生素耐藥率統(tǒng)計 %

2.3 豬源大腸桿菌分離株耐藥基因檢測隨機選擇不同豬場來源大腸桿菌分離株(每個豬場來源隨機選取5株，共175株)進行常見耐藥基因檢測;PCR結(jié)果表明檢測的13種耐藥基因均能擴增出特異性目的片段。將對應(yīng)PCR產(chǎn)物測序序列在NCBI比對后，陽性基因序列與GenBank參考序列同源性在95%以上，表明PCR陽性目的基因與本研究測定的目的基因相符合。耐藥基因檢測統(tǒng)計結(jié)果見表5，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCTX的檢出率分別為30.85%(54/175)和15.42%(27/175)；磺胺類耐藥基因sulⅠ和氯霉素類耐藥基因floR檢出率分別為37.71% (66/175)和57.14%(100/175);氨基糖苷類耐藥基因aph(3)-Ⅱa、aac(3)-Ⅰb、ant(3)-Ⅰa和aac(3)-Ⅱb檢出率分別為16.00%(28/175),36.57%(64/175),66.28%(116/175),40.57%(71/175);喹諾酮類耐藥基因qnrB、qnrS和aac(6)-Ⅰb檢出率分別為18.85%(33/175),21.14% (37/175),41.71%(73/175);而四環(huán)素類耐藥基因tetM和喹諾酮類耐藥基因qnrA檢出率較低，分別為4.57%(8/175)和1.14%(2/175)。所有大腸桿菌分離株均未檢出blaSHV、tetK、mcr-1和mcr-2耐藥基因。

表5 豬源大腸桿菌耐藥基因檢測統(tǒng)計 %

此外，對大腸桿菌分離株含有的耐藥基因數(shù)量及耐藥基因類別數(shù)量進行統(tǒng)計，結(jié)果表明84.00%(147/175)的大腸桿菌含有2種以上耐藥基因，66.28%(116/175)含有3種以上耐藥基因，37.71%(66/175)含有5種以上耐藥基因，僅7.42%(13/175)大腸桿菌基因組中未發(fā)現(xiàn)被檢測耐藥基因(圖2A)。將陽性耐藥基因進行分類后，僅有10.28%(18/175)大腸桿菌含有1類抗生素耐藥基因，82.28%(144/175)的大腸桿菌分離株基因組中含有2類以上抗生素耐藥基因，其中23.42%大腸桿菌含有2類耐藥基因，27.40%(48/175)含有3類耐藥基因，22.85%(40/175)含有4類耐藥基因，8.57%含有5類耐藥基因，未發(fā)現(xiàn)同時含有6類耐藥基因的菌株(圖2B)。

3 討論

由于大腸桿菌容易獲得耐藥性，常被用作監(jiān)測細菌抗生素耐藥性指標(biāo)[14-19]。因此，本研究以大腸桿菌為研究對象，從吉林省規(guī)?；i養(yǎng)殖場斷奶仔豬腹瀉糞便和健康糞便樣本中分離大腸桿菌，并對其耐藥性和耐藥基因進行檢測。

從大腸桿菌分離率結(jié)果可以看出，無論是斷奶仔豬腹瀉糞便樣本源大腸桿菌還是健康糞便樣本大腸桿菌，均呈現(xiàn)較高的分離率，兩者無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能由于大腸桿菌屬于條件致病菌，而引起斷奶仔豬腹瀉的原因錯綜復(fù)雜，還可能與環(huán)境、飲食、氣候以及自身免疫力相關(guān)[7]。由于腹瀉糞便樣本采集于多個市(縣)的多個豬場，大腸桿菌分離率呈現(xiàn)地區(qū)差異，其中松原市長嶺縣樣本(81份，3個豬場)和臨江市樣本(100份，2個豬場)大腸桿菌分離率最高，達到100.00%，梨樹縣樣本(150份，5個豬場)大腸桿菌分離率最低，僅為44.00%。其余地區(qū)豬場大腸桿菌分離率在64.60%～91.67%，不同地區(qū)腹瀉糞便樣本之間的大腸桿菌分離率差異性可能由于不同豬場用藥差異導(dǎo)致。此外，大腸桿菌的污染會加重其他致病菌感染，因此，需要制定合理措施減輕豬場大腸桿菌污染。

本研究對所有大腸桿菌分離株進行藥物敏感性測定，多重耐藥性菌株達到100.00%，而劉哲等[6]對2016年吉林省豬源大腸桿菌分離株(42株)藥敏測定結(jié)果顯示多重耐藥率為93.84%，這表明吉林省生豬養(yǎng)殖場大腸桿菌耐藥情況嚴重，且在不斷加重。 在測定的10類抗生素中，大腸桿菌分離株對β-內(nèi)酰胺類(青霉素、氨芐西林)、大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、強力霉素)以及氨基糖苷類(鏈霉素)具有高度耐藥性(耐藥率>90%)，而這幾類抗生素均被批準用于生豬養(yǎng)殖業(yè)中，普遍用于獸醫(yī)臨床[20]，進一步表明大腸桿菌耐藥性與抗生素使用時間和廣泛性有直接關(guān)系。相比之下，大腸桿菌分離株對頭孢類(<40.00%)和磷霉素類(6.99%)抗生素耐藥率較低，值得注意的是，未發(fā)現(xiàn)多黏菌素耐藥菌株。這與劉哲等[6]對吉林和河南以及戴秀美等[21]對伊通和哈爾濱地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性研究結(jié)果相似，大腸桿菌對不常用的抗生素耐藥率低，基于此可考慮用藥方向。此外，不同研究結(jié)果存在部分差異，可能與研究樣本采集量及采集地點差異有關(guān)。

菌株耐藥基因與藥物敏感性存在一定的相關(guān)性，對大腸桿菌耐藥基因進行檢測有助于了解流行株耐藥基因存在的種類、數(shù)量及流行規(guī)律，能夠更好地指導(dǎo)臨床用藥。本研究結(jié)果顯示氨基糖苷類、氯霉素類、磺胺類以及喹諾酮類耐藥基因均被檢出，但檢出率均低于相應(yīng)抗生素耐藥率，這可能與抗生素存在多種耐藥機制有關(guān)。氯霉素類耐藥基因floR和氨基糖苷類耐藥基因ant(3)-Ⅰa檢出率較高，這可能是該類抗生素的主要耐藥機制。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌因其均可在臨床患者及健康人群檢出而受到關(guān)注[22]，豬源大腸桿菌被認為可能是人類傳染源之一。本研究檢測到blaTEM和blaCTX2種基因，未檢測出blaSHV基因，這與之前研究結(jié)果相似，但blaTEM基因檢出率低于之前研究結(jié)果[7,23]。此外，四環(huán)素耐藥基因tetM檢出率較低，僅為4.75%，且未檢測到tetK基因，而四環(huán)素對大腸桿菌分離株表現(xiàn)出極高耐藥率，具體耐藥機制有待進一步研究。

綜上，本研究展示了吉林省生豬養(yǎng)殖場豬源大腸桿菌的耐藥性和耐藥基因攜帶情況，為臨床用藥提供指導(dǎo)意見，為進一步研究大腸桿菌耐藥分子機制奠定了基礎(chǔ)。