馬皰疹病毒1型TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

胡 月,劉建華,王雪竹,車(chē)傳忠,吳桂靈,加爾肯,冉多良

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus 1，EHV-1)被廣泛認(rèn)為是一種與馬呼吸道感染相關(guān)的病原體，此外它還能引起孕馬流產(chǎn)、新生兒死亡和馬皰疹病毒脊髓腦病(equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)，不同EHV-1毒株感染引起的臨床癥狀差異明顯[1]。其所致疾病名為馬皰疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)，在世界范圍內(nèi)普遍存在。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海關(guān)總署將該病列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病[2]。據(jù)歷年的血清學(xué)調(diào)查顯示，該病在我國(guó)的分布廣泛[3]。2018—2019年新疆部分地區(qū)該病的陽(yáng)性率高達(dá)39.34%，疫情形勢(shì)嚴(yán)峻，給馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展帶來(lái)了極大威脅[4]。

與其他皰疹病毒一樣，EHV-1能在其宿主體內(nèi)建立潛伏感染。無(wú)癥狀感染者會(huì)出現(xiàn)間歇性排毒，使得病毒在馬群中傳播，可導(dǎo)致EHV-1相關(guān)疾病的意外暴發(fā)[5]。由EHV-1引起的大規(guī)模流產(chǎn)和圍產(chǎn)期小馬駒死亡是造成經(jīng)濟(jì)損失的重要原因，而EHV-1相關(guān)呼吸系統(tǒng)疾病導(dǎo)致賽馬的訓(xùn)練時(shí)間損失和比賽成績(jī)差、EHM的暴發(fā)導(dǎo)致賽馬淘汰等情況同樣是制約馬業(yè)發(fā)展的重要因素[6]。因此，需要快速和可靠的診斷工具來(lái)檢測(cè)EHV-1感染，以便能及時(shí)采取措施減少病毒傳播的影響。

常用的診斷方法中，病毒分離鑒定法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且安全性低；血清學(xué)診斷方法的結(jié)論性較低，需要急性和恢復(fù)期血清樣本；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)方法的敏感性較低，具有假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是批量樣品檢測(cè)時(shí)易污染，這些方法均不適用于病毒的早期診斷[7]。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，適合大批量樣品檢測(cè)，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行病毒DNA的定量，有利于疾病的早期診斷和潛伏感染檢測(cè)[8]。本研究旨在建立一種高特異性、靈敏性的針對(duì)EHV-1的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以便在臨床或?qū)嶒?yàn)室中對(duì)EHV-1進(jìn)行快速診斷和定量分析，以清除EHV-1病原攜帶馬匹，為我國(guó)馬業(yè)的發(fā)展保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞EHV-1 XJ2015株、RK-13細(xì)胞系、馬皰疹病毒2型(EHV-2)、馬皰疹病毒4型(EHV-4)、馬皰疹病毒5型(EHV-5)、馬動(dòng)脈炎病毒(equine arteritis virus，EAV)基因組由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院保存；馬流感病毒(equine influenza virus，EIV)基因組由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器Prime STAR?Max Polymerase和熒光定量PCR Probe Mix購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pEASY?-Blunt 3 Cloning Kit和Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物公司；2×Taq plus MasterMix(含染料)購(gòu)自Biosharp公司；病毒DNA的抽提試劑盒、DNA的膠回收純化試劑盒和DNA質(zhì)粒的小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Fast 7500)購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成參照NCBI中GenBank收錄的EHVs基因組序列，與本實(shí)驗(yàn)室已分離鑒定的EHV-1 XJ2015株，通過(guò)BioEdit及ClustalX軟件對(duì)病毒的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出特異性較高的ORF68基因作為靶基因。針對(duì)ORF68基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物及探針由上海生物工程股份有限公司合成。ORF68-F：5′-CGTATTGGCATCTGAACCGC-3′；ORF68-R：5′-CTACA-CGCCTTTGGTAGGG-3′；TaqMan探針：5′-FAM-CCCATAGTGGTACGCTCCGCCGATCTCT-BH-Q1-3′。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備以EHV-1 XJ2015株全基因組DNA為模板，用ORF68-F/R引物進(jìn)行擴(kuò)增。回收目的片段并與pEASY-Blunt 3載體連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果無(wú)誤后測(cè)定質(zhì)粒濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，即為標(biāo)準(zhǔn)品，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR方法的建立根據(jù)熒光定量PCR Probe Mix說(shuō)明書(shū)優(yōu)化反應(yīng)體系，最終確定體系為20.00 μL，其中Probe qPCR Mix(2×)10.00 μL，Probe(0.35 μmol/L)0.70 μL，Rox 0.20 μL，上、下游引物(0.10 μmol/L)各0.20 μL，模板2.00 μL，RNase free H2O 6.70 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20 s，95℃變性3 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，設(shè)陰性對(duì)照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 敏感性、特異性及重復(fù)性試驗(yàn)以8個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR和常規(guī)PCR反應(yīng)，對(duì)比2種方法的敏感性。以EHV-1、EHV-2、EHV-4、EHV-5、EAV及EIV的核酸為模板，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，RNase free H2O作為陰性對(duì)照，進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證該方法的特異性。分別取3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，按確定的條件進(jìn)行熒光定量PCR以分析組間重復(fù)性;每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，以分析組內(nèi)重復(fù)性,計(jì)算Ct值的變異系數(shù)(CV)，評(píng)估重復(fù)性。

1.7 臨床樣品的檢測(cè)將2020年收集自新疆伊犁地區(qū)的60份伴有呼吸系統(tǒng)疾病癥狀的馬匹鼻拭子分別用本研究建立的熒光定量PCR方法與宋煥堂等[9]建立的EHV-1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR法以及常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，比較2種方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 ORF68基因遺傳進(jìn)化分析EHV-1 XJ2015株 ORF68基因核苷酸序列長(zhǎng)度為1 653 bp，經(jīng)基因相似性分析表明，XJ2015株 ORF68基因與EHV-1毒株相似性在75.2%～100.0%，其中，與分離自瞪羚的94-137株和分離自中亞野驢的T-529株相似性均為75.2%，與分離自馬匹的毒株相似性為99.9%～100.0%,而與EHV-2、EHV-3、EHV-4、EHV-5、EHV-8、EHV-9同源性為28.5%～70.6%；經(jīng)基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析表明，ORF68基因可以將不同馬皰疹病毒分別聚類(lèi)(圖1)。

A.相似性分析；B.遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備重組質(zhì)?？截悢?shù)為1.02×1010拷貝/μL，在1.02×103～ 1.02×109拷貝/μL具有良好的線性關(guān)系(圖2)，回歸方程：y=-3.129(x)+46.402，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，擴(kuò)增效率E=1.089。

圖2 熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，熒光定量PCR方法能檢出的最低拷貝數(shù)為1.02×101拷貝/μL(圖3)，而常規(guī)PCR方法檢出的最低拷貝數(shù)為1.02×104拷貝/μL(圖4)。該熒光定量PCR方法是常規(guī)PCR方法敏感性的1 000倍，表明該方法具有較高的靈敏性。

1～8.標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為1.02×107～1.02×100 拷貝/μL；9.陰性對(duì)照

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～10.1.02×108 ～1.02×100 拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明該方法僅能擴(kuò)增重組質(zhì)粒及EHV-1的核酸，其他病原及陰性對(duì)照均無(wú)特異性擴(kuò)增(圖5)，表明該方法具有良好的特異性。

1．重組質(zhì)粒；2．EHV-1；3．EHV-2；4．EHV-4；5．EHV-5；6．EAV；7．EIV；8．陰性對(duì)照

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，批次內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)在0.8%～1.5%，批次間試驗(yàn)變異系數(shù)在1.8%～2.0%，批次間和批次內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，Ct值的變異系數(shù)均小于等于2.0%，表明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性(表1)。

表1 熒光定量 PCR 重復(fù)性試結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果本研究建立的EHV-1 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值小于35，擴(kuò)增曲線良好可判定為陽(yáng)性；Ct值在35～38需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，2次試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線均有良好的線性關(guān)系(“S”型)則判定為陽(yáng)性，Ct值大于38的判定為陰性。檢測(cè)顯示，常規(guī)PCR、SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR、TaqMan熒光定量PCR的陽(yáng)性檢出率分別為21.67%，23.33%，26.67%；TaqMan熒光定量PCR檢出的陽(yáng)性樣品數(shù)最多，且包含了另2種方法檢出的所有陽(yáng)性樣品；隨機(jī)選取10份使用TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的臨床樣本擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析表明，所有擴(kuò)增產(chǎn)物與EHV-1 XJ2015株ORF68基因片段相似性為100.00%，進(jìn)一步證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物中含有EHV-1核酸。由此證明本研究建立的方法更為敏感、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于臨床檢測(cè)(表2)。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

EHV-1是皰疹病毒目，皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬的一員。馬皰疹病毒3型(EHV-3)、EHV-4、馬皰疹病毒8型(EHV-8)和馬皰疹病毒9型(EHV-9)也屬于α亞科。EHV-2和EHV-5屬于γ亞科。這些馬皰疹病毒的臨床癥狀有相似之處，且均具有相同結(jié)構(gòu)的線性雙鏈基因組[10]。但由于EHV-1和EHV-4均能引起馬屬動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病，曾被認(rèn)為是馬鼻肺炎的病原體，研究者們一直將區(qū)分EHV-1和EHV-4當(dāng)作研究的重點(diǎn)。然而，對(duì)不同馬皰疹病毒的氨基酸序列鑒定分析表明，EHV-8和EHV-9與EHV-1的親緣關(guān)系更密切，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無(wú)法有效地將他們區(qū)分[11]。2003—2015年，從愛(ài)爾蘭馬流產(chǎn)病例中分離出的2株EHV-8病毒最初被誤診為EHV-1[12]。2010年，中國(guó)東北的馬流產(chǎn)病例中分離得到了EHV-8毒株(Wh株)，并首次獲得了EHV-8的全基因組序列[13]。EHV-9最初被命名為瞪羚皰疹病毒1型，因其可以與EHV-1發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)且在遺傳上接近EHV-1而最終被重新命名為EHV-9[14]。據(jù)報(bào)道，自然感染EHV-9會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)頸鹿和北極熊致命的腦炎，試驗(yàn)感染表明EHV-9可以引起倉(cāng)鼠、小鼠、馬和山羊的腦炎[15]。EHV-9具有廣泛的宿主范圍和強(qiáng)烈的神經(jīng)趨向性，而EHV-1通常只在敘利亞倉(cāng)鼠和馬匹中顯示神經(jīng)致病性[16]。目前，中國(guó)新疆沒(méi)有關(guān)于EHV-8或EHV-9疫情的報(bào)告，但無(wú)法排除EHV-8或EHV-9流行的可能性。

本研究通過(guò)對(duì)NCBI收錄的EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-8和EHV-9的77個(gè)基因序列比對(duì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)ORF68基因在馬皰疹病毒中的同源性最低，而在EHV-1中表現(xiàn)出較高的保守性，在馬源性毒株中的相似性高達(dá)99.9%～100.0%。因此，根據(jù)該基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了EHV-1 TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法。但由于未能收集到EHV-8和EHV-9的核酸樣本，本研究?jī)H對(duì)其他幾種馬病毒(EHV-2、EHV-4、EHV-5、EAV、EIV)進(jìn)行檢測(cè)，均呈陰性,顯示該方法具有良好的特異性。靈敏度研究表明，該方法的最低病毒檢出量為10.20 拷貝/μL，是常規(guī)PCR方法的1 000倍，與2016年宋煥堂等[9]建立的EHV-1 SYBR Green Ⅰ(最低檢出量為23.00 拷貝/μL)和2019年林志雄等[17]建立的馬鼻肺炎雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法(最低檢出量為147.00 拷貝/μL)相比，敏感性更好。雖然本方法的靈敏度比2020年雷程紅等[18]建立的馬皰疹病毒1型3D數(shù)字PCR檢測(cè)方法略低(最低檢出量為5.83拷貝/μL，變異系數(shù)為0.65%～3.20%)，但重復(fù)性更具優(yōu)勢(shì)。此外，本研究建立的TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)成本較低，可在60 min內(nèi)快速批量檢出EHV-1的陽(yáng)性率及病毒載量，可用于EHV-1的快速診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查及潛伏感染調(diào)查，也可通過(guò)定量分析病毒基因拷貝數(shù)，為EHV-1相關(guān)疫苗及藥物的安全性、有效性等指標(biāo)提供檢測(cè)方法，具有較廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。