1株鴨源H1亞型禽流感病毒的分離鑒定與全基因遺傳進(jìn)化分析

張?chǎng)戊?才天宇,趙 穎,葛志闖,徐 凡,顧欣怡,徐欣然,王曉泉,2,3,顧 敏,2,3*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009)

A型流感病毒屬于正黏病毒科，是單股負(fù)鏈分節(jié)段的RNA病毒，根據(jù)其表面抗原血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性差異，可分為18種不同的HA亞型和11種NA亞型[1]。其中，H1亞型具有較廣泛的宿主譜，不僅能夠感染禽類(lèi)，也是豬和人體內(nèi)常見(jiàn)的流感病毒亞型。禽群中的H1亞型雖然屬于低致病性禽流感病毒，但其能夠突破宿主屏障傳播至豬，例如當(dāng)前豬群中廣泛流行的歐亞類(lèi)禽型H1N1豬流感病毒的原型即來(lái)源于禽，并且豬可以作為“混合器”促進(jìn)不同流感病毒的基因重配；而人的大流行流感中有2次均是由H1亞型引起的，1918年的H1N1大流感曾造成約五千萬(wàn)人死亡[1-3]。另外，有研究表明，2009年分離自北美野鳥(niǎo)體內(nèi)的H1N1亞型禽流感病毒不需要中間宿主的預(yù)先適應(yīng)就具備在哺乳動(dòng)物間進(jìn)行氣溶膠傳播的能力，提示這類(lèi)病毒引起流感大流行的重要潛能不容小覷[4]。因此，監(jiān)測(cè)禽群中H1亞型流感病毒的遺傳變異具有重要的公共衛(wèi)生意義。

本實(shí)驗(yàn)室于2018年在對(duì)江蘇某活禽交易市場(chǎng)進(jìn)行禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查中，分離鑒定了1株鴨源H1N2亞型禽流感病毒A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)(0151株)，并對(duì)其進(jìn)行了全基因的擴(kuò)增與測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在進(jìn)一步了解H1亞型禽流感病毒的變異與進(jìn)化特點(diǎn)，豐富該亞型流感病毒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與雞胚H1N2亞型禽流感病毒株 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)， 于2018年1月分離自江蘇地區(qū)某活禽交易市場(chǎng)的表觀健康鴨群，通過(guò)采集喉部與泄殖腔棉拭，處理后接種雞胚，由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室分離及保存；SPF雞胚購(gòu)買(mǎi)自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室孵化至9～11日齡備用。

1.2 主要試劑RNA提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)自北京原平皓公司；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker購(gòu)買(mǎi)自寶生物(大連)有限公司；dNTP Mix購(gòu)買(mǎi)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Biowest Regular AGAROSE G-10(西班牙瓊脂糖)購(gòu)買(mǎi)自上海玉博生物科技有限公司；10 000×Solar red核酸染料購(gòu)買(mǎi)自Biotium公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成各基因節(jié)段PCR擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[5]。反轉(zhuǎn)錄引物采用IAV通用的12堿基引物：5′-AGCAAAAGCAGG-3′。以上引物全部由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 病毒的分離與鑒定將活禽市場(chǎng)采集到的棉拭樣品保存于含有抗生素的無(wú)菌PBS緩沖液中，無(wú)菌處理后取上清接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，并將接種后的雞胚置于35℃孵化箱中培養(yǎng)。收取96 h內(nèi)自然死亡和未死亡雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)。將有HA效價(jià)的尿囊液與針對(duì)各亞型禽流感病毒及新城疫病毒的多抗血清分別進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(HI)，用于鑒定其HA亞型或是否為新城疫病毒。將收集的尿囊液保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增參照原平皓RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)尿囊液中的RNA進(jìn)行提取，再使用12堿基引物并按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。利用文獻(xiàn)[5]中的引物及擴(kuò)增方法對(duì)各基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.6 基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。利用DNAStar軟件中的Editseq模塊進(jìn)行序列拼接，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST在線工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與該分離株各基因節(jié)段核苷酸序列一致性最高的病毒株，使用MEGA 7.0軟件繪制各基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離及鑒定HA與HI的結(jié)果顯示，編號(hào)為0151的棉拭樣品接種SPF雞胚所收取的尿囊液僅與H1亞型禽流感病毒多抗血清發(fā)生作用，而不與其他亞型禽流感病毒及新城疫病毒多抗血清反應(yīng)，初步鑒定為H1亞型禽流感病毒。為進(jìn)一步了解該0151病毒株的基因序列及其進(jìn)化特點(diǎn)，對(duì)8個(gè)基因片段分別進(jìn)行了序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2.2 基因組序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析

2.2.1HA基因序列分析 0151株HA基因的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)全長(zhǎng)為1 701 bp，編碼566個(gè)氨基酸組成的血凝素蛋白；其中HA1包含344個(gè)氨基酸，HA2為221個(gè)氨基酸，兩者在裂解位點(diǎn)處的氨基酸基序?yàn)镻SIQSR↓GLF，僅含有1個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白存在6個(gè)保守的潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第27，28，40，104，304，498位。通過(guò)對(duì)HA基因結(jié)合唾液酸(sialic acid，SA)受體類(lèi)型的位點(diǎn)分析，該分離株HA基因的受體結(jié)合位點(diǎn)處關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分別為190E、220R、225G、226Q、228G，表明該病毒具有典型的禽源受體結(jié)合特征[6]。BLAST搜索顯示，0151株的HA基因與A/pintail/Taiwan/WB2478/2017(H1N3)具有最高的核苷酸相似性，為98.76%(表1)。進(jìn)一步將0151株與從GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得的部分禽、豬、人源H1N2亞型流感病毒參考株的HA基因序列共同構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1所示，0151株的HA基因?qū)儆跉W亞譜系的禽源H1N2分支，明顯不同于豬源和人源H1N2分支。

表1 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)各基因片段經(jīng)BLAST獲得的核苷酸一致性最高病毒株

圖1 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒HA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.2.2NA基因序列分析 NA基因的ORF全長(zhǎng)為1 410 bp，編碼469個(gè)氨基酸，未出現(xiàn)可能導(dǎo)致病毒在陸禽中適應(yīng)性增強(qiáng)的莖部氨基酸缺失[7]。對(duì)NA蛋白進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，表明其在第61，69，146，200，234，402位共存在6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。BLAST分析的結(jié)果顯示，0151株的NA基因與A/chicken/Yuhuan/YH14/2016(H1N2)的核苷酸相似度最高，達(dá)98.07%。序列比對(duì)分析還指出，該NA蛋白上不存在能夠造成流感病毒對(duì)NA抑制劑類(lèi)抗流感藥物，如奧斯他韋，耐藥性增強(qiáng)的H274Y和R292K突變[8]。繪制的NA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)如圖2所示，0151株仍位于歐亞譜系的禽源H1N2分支，而與豬源和人源H1N2病毒的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖2 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒NA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

2.2.3內(nèi)部基因序列分析 PB2基因的編碼區(qū)含有2 280 bp的核苷酸，共編碼759個(gè)氨基酸。關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的分析表明，該0151株的PB2蛋白上不存在如E627K與D701N等與跨宿主傳播和增強(qiáng)流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性的重要突變[9]。據(jù)于志君等[10]報(bào)道，將H1N2亞型病毒 A/black-necked crane/Zhaotong/ZT-12/2013(H1N2)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)傳代，其鼠適應(yīng)株除了具備HA蛋白的G228S和M1蛋白的D231N突變，還在PB2蛋白上獲得了L134H、I647L和D701N的氨基酸突變；而本研究中0151株的PB2基因在上述3個(gè)位點(diǎn)分別為134H、647I和701D。BLAST結(jié)果顯示，0151株的PB2基因與我國(guó)2013年分離的1株鴨源低致病性H7N3亞型禽流感病毒A/duck/Jiangxi/21224/2013(H7N3)的核苷酸相似度最高，為98.50%(表1)。

0151株P(guān)B1基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度為2 277 bp，共編碼758個(gè)氨基酸，不存在已報(bào)道能夠增強(qiáng)流感病毒在雪貂中傳播性的PB1基因I368V突變[11]。BL-AST分析顯示，該P(yáng)B1基因與A/mallard/Shanghai/NH011204/2018(H12N5)具有最高的核苷酸相似度，為99.69%(表1)。PA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為2 151 bp 的核苷酸，編碼716個(gè)氨基酸。BLAST搜索到與0151株P(guān)A基因核苷酸相似度最高的為日本鴨源分離株A/duck/Hokkaido/W165/2015(H11N6)，達(dá)99.36%(表1)。NP基因編碼區(qū)含有1 497 bp的核苷酸，編碼498個(gè)氨基酸。經(jīng)BLAST查詢(xún)與0151株高度同源的病毒株為野生水禽源A/wildgoose/dongtinglake/121/2018(H6N2)，核苷酸相似度高達(dá)99.46%(表1)。M基因編碼區(qū)全長(zhǎng)982 bp，編碼M1與M2蛋白；其M1上未發(fā)現(xiàn)與H1N2亞型禽流感病毒鼠適應(yīng)相關(guān)的D231N氨基酸突變，M2上也不存在與金剛烷類(lèi)藥物耐藥性增強(qiáng)相關(guān)的S31N氨基酸突變[10,12]。如表1所示，BLAST所得與0151株相似度最高的毒株為蒙古鴨源分離株A/duck/Mongolia/826/2019(H4N6)，核苷酸一致性為99.89%。NS基因編碼區(qū)含838 bp核苷酸，編碼NS1與NS2蛋白，其中NS1蛋白上存在可能致使流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性增強(qiáng)的P42S氨基酸突變[13]。BLAST還發(fā)現(xiàn)，0151株NS基因與國(guó)內(nèi)2013年分離自鴨群中的1株低致病性H7N7亞型禽流感病毒A/duck/Huzhou/4268/2013(H7N7)的核苷酸相似度最高，為98.91%。

0151株P(guān)B2、PB1、PA、NP、M和NS共6個(gè)內(nèi)部基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分別如圖3～8所示，它們的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與HA(圖1)和NA基因(圖2)的類(lèi)似，0151株均與經(jīng)BLAST檢索到核苷酸一致性程度最高的病毒株聚集形成小分支，被劃分在歐亞譜系的禽源分支，而與豬源和人源分支病毒明顯不同。

圖3 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒PB2基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖4 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒PB1基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖5 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒PA基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖6 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒NP基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

水禽是禽流感病毒的天然貯存宿主，幾乎所有亞型的禽流感病毒均能從水禽中分離到。水禽感染禽流感病毒后常呈現(xiàn)隱性感染，并且很容易出現(xiàn)混合感染的情況。由于流感病毒基因組分節(jié)段的特性，極容易在感染動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生基因片段間的重配現(xiàn)象，導(dǎo)致新型流感病毒的出現(xiàn)，進(jìn)而威脅禽類(lèi)、哺乳動(dòng)物甚至人類(lèi)的健康[14]。H1亞型流感病毒在禽、豬、人等動(dòng)物群體中廣泛存在，并能通過(guò)不同宿主源病毒之間的基因重配而產(chǎn)生危害嚴(yán)重的重組株。例如，導(dǎo)致2009年甲型H1N1流感大流行的pdm09病毒，即被認(rèn)為在豬源H1N1病毒的基因組骨架上整合了禽源PB2和PA基因以及人源PB1基因而重組產(chǎn)生[15]。

圖7 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒M基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

圖8 A/duck/Huaian/0151/2018(H1N2)病毒NS基因遺傳進(jìn)化樹(shù)

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)華東地區(qū)活禽市場(chǎng)禽流感病毒進(jìn)行流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的過(guò)程中，從表觀健康家鴨體內(nèi)分離出1株H1N2亞型病毒。為了解該亞型毒株的分子特征和遺傳進(jìn)化狀況，對(duì)該0151分離株進(jìn)行了全基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。BLAST結(jié)果(表1)顯示，0151株的8個(gè)基因片段與H1N2、H1N3、H4N6、H6N2、H7N3、H7N7、H11N6、H12N5等眾多亞型低致病性禽流感病毒具有最高的核苷酸一致性，且這些高度同源的病毒株多為鴨和鵝來(lái)源，地域涉及日本、蒙古和中國(guó)的江西、上海、江蘇、云南、浙江等地，表明該H1N2毒株具有較為復(fù)雜的基因組構(gòu)成，可能通過(guò)多亞型間不斷發(fā)生基因重配所產(chǎn)生，而水禽可能充當(dāng)了重要的重組場(chǎng)所。通過(guò)參考近年來(lái)部分人、豬、禽源H1N2病毒繪制0151株各基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果均顯示，0151株被一致性地劃分在歐亞譜系的禽源分支，獨(dú)立于豬源和人源病毒的進(jìn)化分支，表明0151株的基因組來(lái)源仍為禽源特征，未與豬源、人源的病毒株發(fā)生跨宿主的基因重配。

根據(jù)推導(dǎo)的氨基酸序列，該H1N2毒株HA蛋白裂解位點(diǎn)處的氨基酸基序符合低致病性禽流感病毒特征，受體結(jié)合位點(diǎn)處均為禽源特征性的氨基酸；NA基因莖部未出現(xiàn)氨基酸缺失；內(nèi)部基因中除了NS1蛋白的P42S突變，不存在如PB2蛋白的E627K、D701N，PB1蛋白的I368V的突變可以導(dǎo)致禽源病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)致病性或傳播性增強(qiáng)的關(guān)鍵氨基酸突變[7-9,11-13]。并且，NA和M2蛋白上均未出現(xiàn)與增強(qiáng)神經(jīng)氨酸酶抑制劑類(lèi)和離子通道類(lèi)抗流感藥物耐藥性的相關(guān)氨基酸位點(diǎn)變異[16]。另外，0151株的基因組上也不存在可以導(dǎo)致該H1N2亞型禽流感病毒獲得對(duì)BALB/c小鼠致病力增強(qiáng)的HA蛋白G228S、M1蛋白D231N和PB2蛋白L134H、I647L和D701N等適應(yīng)性氨基酸突變[10]。因此，提示0151分離株可能仍主要表現(xiàn)禽源病毒的基本生物學(xué)特性，尚未表現(xiàn)出對(duì)哺乳動(dòng)物的高危害性。

綜上，本研究對(duì)1株鴨源H1N2亞型禽流感病毒進(jìn)行了全基因測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明該分離株可能由多種不同亞型低致病性禽流感病毒通過(guò)廣泛的基因重配而產(chǎn)生，但在系統(tǒng)發(fā)生上仍位于歐亞譜系的禽源分支，而與豬源或人源病毒株不存在明顯的進(jìn)化關(guān)聯(lián)；同時(shí)，該病毒株仍呈現(xiàn)禽源流感病毒的基因組分子特征，提示其可能尚不具備對(duì)公共衛(wèi)生安全的直接危害，但相關(guān)生物學(xué)特性有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。