REV感染對SPF雛雞胸腺細(xì)胞凋亡及BCL-2的影響

吳文杰，趙晨輝，邊 洋，高雪麗，劉超男，呂曉萍，顧先哲，鄭世民

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實驗動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus，REV)感染多種禽類引起的病理綜合征，其癥狀包括免疫抑制、急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、矮小綜合征等。REV的宿主限于禽類，包括火雞、雞、日本鵪鶉、鴨等，主要侵害并損傷禽免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊等)，引起免疫抑制。感染REV的禽類免疫機(jī)能下降，除導(dǎo)致病禽對其他禽病疫苗的應(yīng)答機(jī)能減弱、甚至喪失外，常常出現(xiàn)繼發(fā)感染和混合感染，對禽類養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。目前報道的REV主要有2種類型的毒株：REV-T株為復(fù)制缺陷型，分離自疑似淋巴細(xì)胞白血病的成年火雞[1]；REV-A株為復(fù)制輔助型，無致瘤作用，但可輔助T株進(jìn)行復(fù)制[2]。

REV自身能夠調(diào)控感染細(xì)胞的凋亡[3]，有研究認(rèn)為[4]，REV感染動物后激活了宿主細(xì)胞的凋亡基因。細(xì)胞凋亡由3種途徑所介導(dǎo)，即外源性途徑、內(nèi)源性途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。其中，內(nèi)源性途徑主要受BCL-2家族調(diào)節(jié)。BCL-2是內(nèi)源性途徑的重要元件，能維持線粒體膜的完整，發(fā)揮抑凋亡作用[5-7]。REV或RE的國內(nèi)外現(xiàn)有研究資料主要集中在該病的流行病學(xué)、病原的分子生物學(xué)、特異性診斷等方面。有關(guān)該病的確切發(fā)生機(jī)制，尤其是分子發(fā)生機(jī)制研究相對較少。BCL-2與REV感染所致SPF雛雞胸腺細(xì)胞凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系也少有研究。故本研究檢測了REV感染SPF雛雞后1,7，14，21，28,42 d，其胸腺細(xì)胞凋亡以及BCL-2的mRNA表達(dá)和蛋白含量的動態(tài)變化，探討REV感染雛雞引起的胸腺細(xì)胞凋亡與BCL-2的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明REV的致病機(jī)制提供重要的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物1日齡SPF雛雞60只，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心，按照SPF雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。

1.2 REV毒株REV-T株，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，菌種號：CVCC NO.CACCAV107。經(jīng)9～11胚齡SPF雞胚増毒后，測定該毒株的TCID50為10-5.64/0.1 mL，使用時將之稀釋105倍。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；TRIzol LS Reagent和M-MLV Reverse Transcriptase(美國英杰生命技術(shù)有限公司)；pMD18-T Vector(大連寶生物工程有限公司)；Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國賽默飛世爾科技公司)；Axy Prep質(zhì)粒DNA小量試劑盒和Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠BCL-2多克隆抗體和辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(英國艾博抗公司)；H600L顯微病理成像系統(tǒng)(日本尼康映像儀器公司)；ELx808酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)；LightCycler 2.0熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.4 試驗設(shè)計和檢測指標(biāo)及方法

1.4.1實驗動物分組及處理 將60只1日齡SPF雛雞隨機(jī)分為REV感染組和對照組，每組30只雛雞。在1日齡時，REV感染組每只雛雞經(jīng)腹腔注射REV稀釋液500 μL，對照組雛雞經(jīng)腹腔注射等量滅菌生理鹽水。在病毒感染后1，7，14，21，28，42 d，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，心臟采血處死，快速采集胸腺，進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.4.2REV感染的SPF雛雞胸腺凋亡細(xì)胞數(shù)量檢測——TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒法 將采集的胸腺固定于4℃冰箱預(yù)冷的10%中性福爾馬林溶液中，制成石蠟切片并常規(guī)脫蠟至水。參照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，隨后脫水、透明、中性樹膠封片，并于油鏡下檢查。每張切片隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.4.3REV感染的SPF雛雞胸腺BCL-2陽性細(xì)胞檢測——免疫組織化學(xué)法 將采集的胸腺固定于4℃冰箱預(yù)冷的10%中性福爾馬林溶液中，制成石蠟切片并常規(guī)脫蠟至水。使用二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、脫水、透明、中性樹膠封片，并于油鏡下檢查。每張切片隨機(jī)選取5個視野，計BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)。同時設(shè)一抗(1∶50稀釋的兔抗鼠BCL-2抗體)和二抗(1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG)對照。

1.4.4REV感染的SPF雛雞胸腺BCL-2蛋白含量檢測——間接ELISA法 將胸腺與裂解液按1∶9混合并充分研磨、離心，取上清并用包被緩沖液1∶800稀釋，4℃冰箱過夜包被。次日，PBST洗滌3次，5 min/次。加封閉液于37℃恒溫箱內(nèi)封閉2 h。PBST洗滌3次，5 min/次。加一抗(1∶4 000稀釋的兔抗鼠BCL-2多克隆抗體)并于37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h，PBST洗滌3次，5 min/次；加二抗(1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG)并于37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h。PBST洗滌3次，5 min/次。加入聯(lián)苯二胺(OPD)，37℃恒溫箱內(nèi)避光顯色15 min。PBST洗滌3次，加入2 mol/L H2SO4終止顯色，于酶標(biāo)儀上測每孔的D490 nm值。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，并設(shè)置空白對照、一抗和二抗對照。

1.4.5REV感染的SPF雛雞胸腺BCL-2 mRNA表達(dá)的檢測—Quantitative real-time PCR法 (1)雞胸腺BCL-2 mRNA表達(dá)qRT-PCR檢測方法的建立：參考GenBank中已發(fā)表序列，利用軟件DNAStar、Oligo 6.0設(shè)計bcl-2、β-actin基因引物(表1)。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

用TRIzol法提取胸腺的總RNA，應(yīng)用Oligo(dT)合成cDNA，并擴(kuò)增目的片段bcl-2、β-actin。每次設(shè)陰性對照和空白對照。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 36.5 μL，10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 5.0 μL，cDNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，rTaq(5 000 U/L)0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物，回收目的條帶并純化。將純化的目的片段與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR及1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性克隆,然后提取、擴(kuò)增重組質(zhì)粒，測序并檢測其D260 nm/D280 nm值。當(dāng)D260 nm/D280 nm值偏離1.8，則進(jìn)一步純化樣品。并對引物濃度、模板用量、退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。將bcl-2、β-actin陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)，以此為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(2×) 10.0 μL，ddH2O 6.4 μL，模板2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸10 s，45個循環(huán)。設(shè)陰性對照。確認(rèn)引物熔解曲線、擴(kuò)增曲線，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用自動分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

(2)REV感染雛雞胸腺BCL-2 mRNA表達(dá)的檢測采用RT-PCR法(2-△△Ct法)：利用本部分(1)中的RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序?qū)?1)中合成的胸腺cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，并設(shè)陰性對照。內(nèi)參基因為β-actin，由儀器輸出Ct值。根據(jù)公式：△△Ct=待測樣本(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-校準(zhǔn)樣本(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)，計算目的基因差異倍數(shù)=2-△△Ct，分析基因表達(dá)的相對差異。

2 結(jié)果

2.1 REV感染的SPF雛雞胸腺中凋亡細(xì)胞數(shù)量變化根據(jù)圖1可知，SPF雛雞感染REV后，其胸腺中凋亡細(xì)胞的數(shù)量在整個試驗期間始終高于對照雛雞，且在感染后21，28 d出現(xiàn)顯著(0.010.05)。

注：比較同一時間不同組別，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；無標(biāo)號則差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)量變化由圖2可見，與對照雛雞相比，病毒感染雛雞胸腺中BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)量均有所增多，并在感染后21，28 d時明顯增多(0.010.05)。

圖2 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)量變化

2.3 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2蛋白含量變化根據(jù)圖3可知，SPF雛雞感染REV后1～42 d，其胸腺中BCL-2蛋白含量均高于對照雛雞。在21，28 d，病毒感染雛雞胸腺的BCL-2蛋白含量較對照雛雞顯著升高(P<0.05)，其余時間點(diǎn)未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖3 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2蛋白含量變化

2.4 qRT-PCR檢測雞胸腺BCL-2 mRNA表達(dá)方法的建立提取胸腺的總RNA(圖4)，可見5S、18S、28S的3條電泳帶清晰，表明提取的RNA質(zhì)量高，完整性好，可用于下一步試驗。合成cDNA后擴(kuò)增目的片段bcl-2、β-actin，條帶大小分別為180，135 bp(圖5A、C)。

M.DL2000 DNA Marker；1.胸腺樣品的總RNA

回收目的條帶并純化，與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽性克隆，結(jié)果見圖5B、D，條帶大小與之前回收條帶一致。對陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank中已收錄的序列NM_205339、AW61617分別進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)序列一致，無核苷酸缺失或突變，此重組質(zhì)?？捎糜诤罄m(xù)試驗。

A. bcl-2基因擴(kuò)增結(jié)果；B.重組質(zhì)粒pMD18-T-bcl-2的鑒定結(jié)果；C.β-actin基因擴(kuò)增結(jié)果；D.重組質(zhì)粒pMD18-T-β-actin鑒定結(jié)果。M.DL2000 DNA Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照

梯度稀釋pMD18-T-bcl-2重組質(zhì)粒和pMD18-T-β-actin重組質(zhì)粒(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8)并進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，SDS軟件生成擴(kuò)增曲線(圖6A、B)、引物熔解曲線(圖6C、D)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6E、F)。pMD18-T-bcl-2重組質(zhì)粒和pMD18-T-β-actin重組質(zhì)粒分別在91℃左右和86℃左右顯示單峰，同時陰性對照曲線平直，說明引物特異性高，擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

A.重組質(zhì)粒pMD18-T-bcl-2標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；B.重組質(zhì)粒pMD18-T-β-actin標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；C.重組質(zhì)粒pMD18-T-bcl-2標(biāo)準(zhǔn)品引物熔解曲線；D.重組質(zhì)粒pMD18-T-β-actin標(biāo)準(zhǔn)品引物熔解曲線；E.重組質(zhì)粒pMD18-T-bcl-2擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線；F.重組質(zhì)粒pMD18-T-β-actin擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2 mRNA表達(dá)變化由圖7可知，SPF雛雞感染REV后，其胸腺中BCL-2 mRNA表達(dá)均出現(xiàn)上升，而且在處理后21，28 d，病毒感染組的BCL-2 mRNA表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)。其余時間點(diǎn)未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

圖7 REV感染的SPF雛雞胸腺中BCL-2 mRNA表達(dá)變化

3 討論

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)可引起病禽的免疫抑制，使病禽對其他生物性致病因素，如禽白血病病毒(ALV-J)、馬立克病病毒(MDV)等的易感性提高，更易出現(xiàn)繼發(fā)感染、混合感染[8-12]。有研究報道[13-14]，在REV與ALV-J共感染的雞胚成纖維細(xì)胞中，上述2種病毒的復(fù)制均得到促進(jìn)，并且在與REV混合感染時，ALV-J誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞凋亡也更加顯著[15],而REV與MDV混合感染可使患病動物病情加重，MDV疫苗的免疫保護(hù)力顯著降低[10];因此對REV感染引起的免疫抑制機(jī)制的研究尤為重要。

免疫器官的損傷、萎縮是REV引發(fā)禽類免疫抑制的主要原因。其中胸腺作為T細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的主要場所，其發(fā)育狀態(tài)與禽免疫功能息息相關(guān)[16-17]。劉丹華等[18]發(fā)現(xiàn)，REV感染雛雞的局部淋巴組織中T細(xì)胞的數(shù)量降低。在FU等[19]的研究中，REV感染造成雛雞的胸腺細(xì)胞凋亡先增多后減少，這與感染雛雞胸腺先萎縮后恢復(fù)的組織學(xué)變化相互印證。本研究中，在整個試驗期間，REV感染的SPF雛雞胸腺的細(xì)胞凋亡始終增多，其中感染后21～28 d尤為明顯(P<0.05)，說明REV感染引起的免疫器官細(xì)胞凋亡與機(jī)體免疫機(jī)能障礙有直接關(guān)聯(lián)。在內(nèi)源性凋亡途徑發(fā)揮重要作用的BCL-2蛋白，其家族成員包括多結(jié)構(gòu)域抑凋亡蛋白(BCL-2、BCL-xL等)、多結(jié)構(gòu)域促凋亡蛋白(BAX、BAK)和促凋亡BH3-only蛋白(BID、BAD等)[20]。這3種類型的蛋白在接收到細(xì)胞凋亡信號后發(fā)揮不同的生物學(xué)作用[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞后，其胸腺BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)量增加，BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量也升高，說明REV感染激活了機(jī)體細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡途徑。在抑凋亡蛋白BCL-2增多的情況下，細(xì)胞凋亡仍然增多。這可能是因為凋亡與否是由促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同決定，而非只受單一因子控制[23]。現(xiàn)有研究證實，在REV感染介導(dǎo)的免疫器官細(xì)胞凋亡中，有1條以上凋亡調(diào)節(jié)通路發(fā)揮了作用。黨盛源[24]在REV感染雛雞胸腺細(xì)胞的研究中，除細(xì)胞凋亡增加外，還檢測到半胱天冬氨酸蛋白酶家族成員Caspase-3、Caspase-8 mRNA表達(dá)和蛋白含量的升高，認(rèn)為Caspase-3、Caspase-8參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。于志強(qiáng)等[25-26]發(fā)現(xiàn)，REV感染雛雞后21～28 d，C-myc、Caspase-6和Caspase-7 mRNA表達(dá)均顯著升高。據(jù)此推測，在多條凋亡相關(guān)通路的共同作用下，促凋亡作用大于BCL-2的抑凋亡作用。凋亡是機(jī)體消除損傷細(xì)胞和衰老細(xì)胞的基本生理過程。REV誘導(dǎo)無需凋亡的細(xì)胞凋亡，引起機(jī)體免疫器官損傷和免疫機(jī)能衰竭。為了拮抗較高的細(xì)胞凋亡水平，機(jī)體可能促進(jìn)抑凋亡因子的產(chǎn)生。因此本研究中REV感染雛雞后，其胸腺的BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量雖然均出現(xiàn)增多，但胸腺細(xì)胞總體上仍呈現(xiàn)為凋亡細(xì)胞的增多。這可能是REV感染的雛雞免疫機(jī)能低下的根本原因所在。本研究從BCL-2入手，探究了在REV感染的SPF雛雞胸腺中的細(xì)胞凋亡情況、BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量及BCL-2陽性細(xì)胞數(shù)量的動態(tài)變化。REV感染SPF雛雞后，雖然其胸腺細(xì)胞中BCL-2 mRNA表達(dá)和蛋白含量及陽性細(xì)胞數(shù)量均有所增加，但細(xì)胞凋亡增加更加明顯，表明REV感染導(dǎo)致的雛雞胸腺細(xì)胞凋亡與病毒所致的感染雛雞免疫機(jī)能低下密切相關(guān)。REV感染引起的細(xì)胞凋亡，特別是BCL-2家族在REV感染所致胸腺細(xì)胞凋亡中的作用及其詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探討。