水稻秸稈降解復(fù)合菌系的篩選構(gòu)建及其田間應(yīng)用效果

李陽陽，陳帥民，范作偉，徐銘鴻，王學(xué)文，張立明，劉慧濤*，吳海燕*

（1 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長春 130033；2 前郭灌區(qū)國營紅旗農(nóng)場，吉林前郭 131105；3 前郭縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，吉林前郭 131100）

我國是糧食生產(chǎn)大國，也是秸稈資源大國，農(nóng)業(yè)每年產(chǎn)生各類農(nóng)作物秸稈約為7億t，其中水稻秸稈每年總產(chǎn)量約達2億t[1–2]。而我國水稻秸稈綜合利用技術(shù)相對落后，大部分秸稈還是以焚燒、堆積的方式處理，不僅造成了嚴重的環(huán)境污染和資源浪費，而且會對土壤微生物、土壤環(huán)境造成嚴重破壞[3–4]。近年來，秸稈還田作為一種保護性耕作措施被大力提倡，被認為是改善土壤理化性狀和提高土壤肥力的有效措施[5]。葉文培等[6]認為秸稈還田對水稻生長發(fā)育和產(chǎn)量有促進作用；劉鵬程等[7]研究認為，水稻秸稈留高茬原位還田后提升了土壤中易氧化態(tài)有機質(zhì)含量，使土壤有機質(zhì)的活性增強，有助于土壤養(yǎng)分供應(yīng)；嚴慧峻等[8]報道水稻秸稈覆蓋和翻壓還田3年后土壤有機質(zhì)含量增加19%以上；周江明等[9]研究認為，水稻秸稈經(jīng)過5年全量原位還田后土壤中的速效氮提高近70%左右，有效磷提升幅度達到90%左右，速效鉀由于其移動性大的原因增加幅度略低一些。秸稈中含有豐富的有機質(zhì)和氮、磷、鉀等礦物元素，通過還田方式可以增強土壤肥力，為土壤微生物提供豐富的碳源和氮源，促進微生物數(shù)量的增加，提高了細菌數(shù)量、多樣性豐富度與多樣性指數(shù)以及土壤微生物群落代謝能力和功能[10]。秸稈還田可明顯增加土壤孔隙度，減輕容重，增加土壤團聚體的數(shù)量，增強土壤保肥保水能力[11]。秸稈還田可以提升土壤有機質(zhì)含量，增加土壤堿解氮和速效鉀含量，提高氮肥利用率和維持土壤鉀素平衡，進而提高水稻產(chǎn)量[12]。水稻秸稈還田不僅能實現(xiàn)資源轉(zhuǎn)化循環(huán)利用，也為其因焚燒或棄置堆積而造成的環(huán)境污染提供了解決方案，從而改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)協(xié)調(diào)健康發(fā)展[13]。

水稻是吉林省第二大糧食作物，2018年水稻種植面積是83.97萬hm2，占吉林省農(nóng)作物總種植面積的14.99%。產(chǎn)量達到646.32萬t，按草谷比1.2∶1的比例計算，水稻秸稈資源量近780萬t[14]。水稻秸稈主要成分分為兩類物質(zhì)，一類是易于降解的蛋白質(zhì)、脂類、礦物質(zhì)等；另一類是難降解的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，占秸稈干物質(zhì)含量的70%～80%，纖維素分子的連接鍵在25℃避光、干燥下半衰期約為 500萬年，自然狀態(tài)下極難分解[15]，大量秸稈殘留在耕作層，對下一個耕作季的插秧以及幼苗生長都產(chǎn)生很大的影響[16]。而且由于水稻秸稈C/N值較高，還田過量或者還田不均勻還會發(fā)生與作物爭奪氮素營養(yǎng)的現(xiàn)象。另外，秸稈還田還會增加稻田土壤CO2和CH4等氣體的排放，增加溫室效應(yīng)，也會對水稻秧苗產(chǎn)生毒害[17]。因此，如何采取有效措施促進秸稈快速腐解是實現(xiàn)農(nóng)作物秸稈資源肥料化、促進黑土地可持續(xù)利用的重要科學(xué)問題。

秸稈腐解菌劑是一類能夠產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶等的多菌株復(fù)合的微生物菌劑，能夠強烈分解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是以速腐秸稈、雜草等為主的一種有機物料生物激發(fā)劑，其施入土壤后能增加分解秸稈的微生物數(shù)量，進而加快秸稈的分解和腐熟過程[18]。大量研究表明，秸稈降解菌不僅可以提高秸稈降解速度，還對土壤養(yǎng)分、土壤微生物、土壤酶活性以及作物產(chǎn)量等起到一定的促進作用，因此被廣泛關(guān)注[19]。目前秸稈降解菌劑的研究以纖維素降解微生物為主[20]。國內(nèi)外的研究工作者已經(jīng)從自然環(huán)境中篩選到了許多具有纖維素降解能力的菌株，包括細菌、真菌、放線菌[21]。已分離的細菌包括假單胞菌屬(Pseudomones)、根瘤菌屬(Rhizobium)、纖維單孢菌屬(Cellulomonas)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)等[22–24]，真菌包括青霉屬 (Penicillium)、木霉屬 (Trichoderma)、毛殼霉屬 (Chaetomium)等[25–27]，放線菌包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)等[28–29]。秸稈降解是多種酶系協(xié)同作用的結(jié)果，單一菌株很難產(chǎn)生較為完全的酶系，因此對秸稈的降解能力有限，多種菌株復(fù)合后可產(chǎn)生多種酶系，從而提高降解效果[30]，人工篩選構(gòu)建能夠產(chǎn)生多種酶的高效穩(wěn)定復(fù)合菌系，成為一個新的研究熱點[31]。

基于以上背景，鑒于東北地區(qū)的氣候特點，水稻秋季收獲后面臨冬季氣溫低、土壤凍結(jié)等實際問題，加之水分條件較差等自然條件的影響，致使水稻秸稈還田后腐解速度緩慢、分解周期長，腐解效果差，春季還會影響插秧緩苗和水稻產(chǎn)量。針對生產(chǎn)中的實際問題，本研究將實驗室條件下篩選復(fù)配的降解效果較好的復(fù)合菌系應(yīng)用于水稻秸稈田間原位還田，研究復(fù)合菌系在田間條件下對水稻秸稈的降解效果以及對土壤有機質(zhì)、土壤養(yǎng)分和水稻生物學(xué)性狀及產(chǎn)量的影響，為北方寒冷地區(qū)水稻秸稈原位還田快速腐解提供優(yōu)良的菌種資源及其組合，也為該復(fù)合菌系的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，是解決東北地區(qū)主要農(nóng)作物秸稈綜合利用的重要措施。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離、純化

菌種分離培養(yǎng)基為羧甲基纖維素(carboxy methyl cellulose,CMC)培養(yǎng)基；純化、保存培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基；篩選培養(yǎng)基包括剛果紅培養(yǎng)基、復(fù)篩培養(yǎng)基、濾紙液體培養(yǎng)基；秸稈液體培養(yǎng)基配方參照張冬雪等[13]的方法。

樣品采集于吉林省松原市前郭縣水稻田帶腐爛秸稈的表層土壤(0—20 cm)，裝于自封袋中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 菌株的分離、純化 稱取5 g土壤樣品加入45 mL無菌水中，于28℃、150 r/min搖床中震蕩培養(yǎng)1 h，將樣品懸液用無菌水稀釋到3個濃度梯度，即103、104、105，分別涂布于CMC培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，分離得到的細菌和真菌分別在LB和PDA培養(yǎng)基中進行5次純化并保存于–80℃超低溫冰箱。經(jīng)過純化后的菌株點接于剛果紅固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天，觀察菌株周圍是否產(chǎn)生透明圈。

1.1.2 菌株的羧甲基纖維素酶活性及秸稈降解效果測定 羧甲基纖維素酶(CMCase)活性測定參照李靜等[32]的方法(DNS法)進行。

濾紙條崩解試驗：將篩選到的具有纖維素降解能力的菌株分別制備成菌懸液(細菌108個/mL，真菌 106個/mL)，取出 10 mL 接種于裝有90 mL濾紙液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)15天，定期觀察濾紙條的崩解情況[13]。

秸稈降解效果測定：在裝有90 mL秸稈液體培養(yǎng)基的三角瓶中分別接入10 mL制備好的菌懸液(細菌108個/mL，真菌106個/mL)，對照組接入10 mL無菌水，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)15天，將培養(yǎng)物離心，棄去上清液并用蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次，80℃烘干至恒重，計算失重率[33]，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.1.3 菌株的鑒定及拮抗試驗 在篩選的菌株中挑選降解效果較好的菌株進行DNA提取，細菌PCR擴增采用的引物為：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和 1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTAC GA-3′)[23]，真菌 PCR 擴增采用的引物為：ITS1 (TCC GTAGGTGAACCTGCGG)和 ITS4 (TCCTCCGCT TATTGATATGC)[16]，擴增的條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 變性 30 s，58℃ 退火 30 s，細菌 72℃延伸90 s，真菌72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。測序后的結(jié)果通過BLAST比對，在GenBank數(shù)據(jù)庫中尋找相似性最大菌株的基因序列，利用MEGA5.2.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

將挑選出的菌株進行兩兩交叉，劃線于羧甲基纖維素固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)3天。若交叉點處兩種菌株生長較弱或不生長，說明兩菌之間有拮抗作用；若交叉點處菌株生長均良好，則說明兩菌之間無拮抗作用。

1.1.4 復(fù)合菌系的構(gòu)建及秸稈降解效果測定 根據(jù)菌株的濾紙條崩解能力、對秸稈的降解能力及拮抗試驗結(jié)果，構(gòu)建復(fù)合菌系。分別將單菌株制備成108個/mL (細菌)或 106個/mL (真菌)的菌懸液，將需要復(fù)合的各菌株按體積比1∶1 或1∶1∶1混合，取10 mL混合均勻的菌懸液，加入到90 mL秸稈液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)7天，取上清液制備粗酶液，參照薩如拉等[34]的方法測定其濾紙酶活性。制備的復(fù)合菌系對秸稈的降解效果的測定方法同1.1.2。

1.2 復(fù)合菌系田間應(yīng)用效果試驗

田間試驗于2020年5—9月，在吉林省松原市前郭灌區(qū)紅旗農(nóng)場 (東經(jīng) 124°96′75″，北緯45°3′35″)進行，試驗區(qū)屬中溫帶半濕潤大陸性季風(fēng)氣候。年平均氣溫4.5℃，年平均日照 2880 h，無霜期141天，年平均降雨量450 mm，6—8月降水量占全年降水量的69%。土壤類型為黑鈣土，耕層土壤為0—20 cm，其基本理化性質(zhì)為：pH 6.72、有機質(zhì)20.4 g/kg、硝態(tài)氮 165 mg/kg、有效磷 37 mg/kg、速效鉀 238 mg/kg。

1.2.1 田間試驗設(shè)計與方法 設(shè)置5個處理：1) 水稻秸稈不還田；2) 水稻秸稈還田不施菌劑；3) 水稻秸稈還田+復(fù)合菌系 b (B2+F12)；4) 水稻秸稈還田+復(fù)合菌系 c (F1+F5+F12)；5) 水稻秸稈還田+復(fù)合菌系d (B2+F5+F12)。在春季插秧前，將水稻秸稈原位粉碎(長度約為10 cm)翻耕還田，還田量約為5 t/hm2。秸稈還田前向秸稈中施入復(fù)合菌系(菌液濃度同1.1.4)，用量為秸稈重量的0.5%。為了便于機械耕作，本試驗不設(shè)重復(fù)，每個處理面積為100 m2。供試水稻品種為吉粳83，各處理氮磷鉀肥用量相同，分別為 N 200 kg/hm2、P2O5100 kg/hm2、K2O 100 kg/hm2，氮肥為尿素，按基肥∶分蘗肥∶穗肥=2∶3∶3施用；磷、鉀肥全作基肥施用。

1.2.2 秸稈降解效果田間試驗 秸稈降解效果的測定利用尼龍網(wǎng)袋進行。將水稻秸稈切割成10 cm長的小段，稱取 30 g 裝入 10 目 (27 cm×32 cm)的尼龍網(wǎng)袋中，于2020年5月11日埋入水稻田，深度10—20 cm，每個秸稈還田處理小區(qū)中埋入12個尼龍網(wǎng)袋。分別于2020年6月21日、7月21日、8月21日和9月21日取樣，每次取3個尼龍袋作為重復(fù)。將尼龍網(wǎng)袋取出后，用水沖凈泥土，挑凈網(wǎng)袋中的水稻根系，將秸稈于80℃烘干至恒重后稱重，分別計算秸稈的降解率。

2020年9月末水稻收獲后，采用五點取樣法在每個試驗小區(qū)用土鉆取0—20 cm的土壤樣品，經(jīng)自然風(fēng)干，土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量分別采用重鉻酸鉀容量法、堿解擴散法、鉬銻抗比色法和火焰光度法[35]測定。

1.2.3 水稻生長及產(chǎn)量測定 從水稻分蘗期(2020年6月10日)開始，每處理按照五點取樣法每點測定5穴，每隔10天(6月20日、6月30日、7月10日、7月20日)測定一次地上部分植株高度和分蘗數(shù)，共計測定5次。水稻成熟后，同樣按照五點取樣法及平均數(shù)法每點取樣30穴，取接近平均穗數(shù)植株10穴，測定每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重等理論產(chǎn)量構(gòu)成因子，計算理論產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用 SPSS 22.0 軟件，采用 LSD 法和 ANOVA方差分析進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選及對濾紙條和水稻秸稈的降解效果

利用剛果紅固體培養(yǎng)基對從土壤樣品中分離出的菌株進行初步篩選，共得到10株具有纖維素降解能力的菌株 (A3、A7、B2、B5、B6、D3、D6、F1、F5、F12)。從表1可知，F(xiàn)12和F5的羧甲基纖維素(CMC)酶最高酶活較大，分別為59.4和50.5 U/mL，D6和D3的CMC最高酶活較小，分別為8.7和14.1 U/mL。不同菌株的最高酶活出現(xiàn)時間也有所不同，B5、F5、F12 在培養(yǎng)第 5 天出現(xiàn)最高酶活，B2、B6、D3、F1在培養(yǎng)第7天出現(xiàn)最高酶活，A3、A7、D6在培養(yǎng)第9天出現(xiàn)最高酶活。經(jīng)過15天的培養(yǎng)，不同菌株對濾紙條的崩解效果也有所不同，F(xiàn)12能在培養(yǎng)5 天內(nèi)將濾紙條完全降解，降解速率最快，F(xiàn)5和F1分別在培養(yǎng)第9和11天將濾紙條完全降解，B5、B2和B6、A3和A7、D3和D6分別在第5、7、9、11天將濾紙條降解成多個較短的片段，之后沒有明顯變化。濾紙條在降解過程中先斷裂成較短的片段，最后降解成糊狀。

表1 各菌株羧甲基纖維素(CMC)酶活性及對濾紙條和水稻秸稈的降解效果Table 1 CMC enzyme activity of different strains and their degradation effect on filter paper and rice straw

在秸稈液體培養(yǎng)基中，未添加降解菌的對照組(CK)對水稻秸稈的降解率為4.5%，分別添加這10種降解菌后，降解率在9.3%～29.1%；菌株F12對水稻秸稈的降解效果最好，降解率為29.1%；菌株B2、B5、B6、F1、F5也有較好的降解效果，降解率分別為19.8%、20.4%、20.9%、23.6%、25.3%；菌株A3、A7、D3、D6的降解效果較一般，降解率分別為14.7%、14.4%、11.1%、9.3%。添加降解菌的處理組對水稻秸稈的降解率均高于CK。

2.2 菌株的鑒定及拮抗試驗結(jié)果

將降解效果較好的菌株B2、B5、B6、F1、F5、F12測序得到的序列在GenBank中進行Blast比對，鑒定這6株菌分別為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)、耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halotolerans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，其最高相似度分別為99.86%、99.93%、99.93%、99.64%、99.64%、99.66% (圖1)。菌株 B2、B5、B6、F1、F5、F12 的登錄號分別為MZ268138、MZ268139、MZ268140、MZ268131、MZ268132、MZ268133。B2、B5、B6為細菌，F(xiàn)1、F5、F12為真菌，細菌和真菌分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1A、B所示。由各菌株間的拮抗關(guān)系(表2)可知，菌株B2與其它5株菌間沒有拮抗作用，而B5、B6、F1、F5、F12都有與其產(chǎn)生拮抗作用的菌株，在構(gòu)建復(fù)合菌系時要將無拮抗作用的菌株進行組合。

圖1 菌株 B2、B5、B6、F1、F5、F12 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 The phylogenetic tree of strains B2,B5,B6,F1,F5,and F12

表2 各菌株間的拮抗關(guān)系Table 2 Antagonistic relationship of strains

2.3 復(fù)合菌系濾紙酶活性及其對水稻秸稈的降解效果

根據(jù)菌株的濾紙條崩解能力、對秸稈的降解能力及拮抗試驗結(jié)果，構(gòu)建7組復(fù)合菌系，分別為a,F5+F12；b,B2+F12；c,F1+F5+F12；d,B2+F5+F12；e,B2+B5+B6；f,B6+F1；g,B6+F5。不同復(fù)合菌系的濾紙酶活性有較大的差異(圖2A)，復(fù)合菌系b、c、d表現(xiàn)出較高的濾紙酶活性，分別為14.0、9.4、19.2 U/mL，復(fù)合菌系a、g的濾紙酶活性次之，分別為7.8和7.1 U/mL，復(fù)合菌系e、f的濾紙酶活性較低，分別為5.1和5.8 U/mL。不同復(fù)合菌系在秸稈液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)15天后，對水稻秸稈也表現(xiàn)出不同的降解效果(圖2B)，復(fù)合菌系b、c、d的秸稈降解率分別為32.9%、29.8%、40.3%，與單株菌降解率最高的菌株F12相比，降解率分別提高了3.8、0.7、11.2個百分點；復(fù)合菌系a、e、f、g的降解率較低，降解率分別為28.6%、21.5%、22.7%、27.8%。從復(fù)合菌系的濾紙酶活性和對水稻秸稈的降解效果可以看出，復(fù)合菌系d表現(xiàn)出最好的纖維素降解能力，b、c次之，故選擇這3組復(fù)合菌系進行下一步研究。

圖2 不同復(fù)合菌系的濾紙酶活性及水稻秸稈的降解率Fig. 2 Filter paper enzyme activities and rice straw degradation rate of different complex microbial syatem

2.4 水稻秸稈原位還田配施復(fù)合菌系的降解效果及對土壤養(yǎng)分含量的影響

水稻秸稈原位還田配施復(fù)合菌系對秸稈降解效果(圖3)表明，隨著埋入土壤時間的延長，水稻秸稈降解率不斷提高，不同復(fù)合菌系也表現(xiàn)出不同的降解效果。埋入土壤130天后，未施用菌劑的處理秸稈降解率為30.4%，施用復(fù)合菌系b、c、d的處理秸稈降解率分別為61.1%、56.2%、67.5%，復(fù)合菌系d表現(xiàn)出的降解效果最好，與未施用菌劑的處理相比，其降解率提高了37.1個百分點；復(fù)合菌系b、c的處理與未施用菌劑的處理相比，降解率分別提高了30.7、25.8個百分點。而且秸稈原位還田并施用菌劑70天內(nèi)，秸稈降解率提高的較快，在收獲前所有菌劑的降解率均達到最大值，施用菌劑處理的秸稈降解率明顯高于未施用菌劑處理的秸稈降解率。

圖3 配施復(fù)合菌系對原位還田水稻秸稈的降解率Fig. 3 In situ degradation rate of complex microbial agents on rice straw

水稻秸稈原位還田配施復(fù)合菌系各處理的土壤養(yǎng)分含量測定結(jié)果表明，秸稈還田處理的土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量明顯高于秸稈不還田處理，而秸稈還田配施復(fù)合菌系處理的土壤養(yǎng)分均高于不施菌劑的處理(表3)。施用復(fù)合菌系B2+F5+F12的土壤養(yǎng)分含量最高，與秸稈還田不施菌劑的處理相比，有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別增加 2.1 g/kg、1.9 mg/kg、0.6 mg/kg、1.7 mg/kg，與秸稈不還田的處理相比差異均達到顯著水平(P<0.05)，與秸稈還田不施菌劑的處理相比，土壤有機質(zhì)和堿解氮含量差異也達到了顯著水平(P<0.05)；施用復(fù)合菌系B2+F12、F1+F5+F12處理次之。土壤養(yǎng)分含量變化結(jié)果與水稻秸稈原位還田配施復(fù)合菌系的降解效果是一致的，所以秸稈原位還田并配施高效的降解菌劑能提高秸稈的降解率，同時增加土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀等土壤養(yǎng)分含量，是促進作物高產(chǎn)的主要原因之一。

表3 不同復(fù)合菌系處理土壤的養(yǎng)分含量Table 3 Nutrient content in soils treated with different complex microbial agents

2.5 水稻秸稈原位還田配施復(fù)合菌系對水稻生長及產(chǎn)量的影響

秸稈不還田(無秸稈無菌劑)、秸稈還田配施復(fù)合菌系(復(fù)合菌系b、c、d)與秸稈還田不施菌劑(無菌劑)相比，對水稻株高和分蘗數(shù)有較為明顯的差異(圖4)，秸稈不還田處理的株高和分蘗數(shù)在前期表現(xiàn)較好，可能是由于還田的秸稈爭奪氮素養(yǎng)分所至，在后期隨著還田秸稈不斷降解釋放出其所含的養(yǎng)分，無秸稈處理的優(yōu)勢不再明顯。最后一次測定時，在秸稈還田處理中，施用復(fù)合菌系d和復(fù)合菌系b與不施菌劑相比，株高分別提高了7.8%和4.2%，均達到差異顯著水平(P<0.05)；分蘗數(shù)分別增加了13.7%和9.0%，復(fù)合菌系d與不施菌劑相比分蘗數(shù)達到差異顯著水平(P<0.05)，復(fù)合菌系b與不施菌劑相比分蘗數(shù)差異不顯著；復(fù)合菌系c與不施菌劑相比，株高和分蘗數(shù)均無顯著差異。3種復(fù)合菌系中，復(fù)合菌系d作用效果最好。

從表4可以看出，秸稈不還田和秸稈還田不施菌劑兩個處理之間的產(chǎn)量差異顯著，秸稈還田不施菌劑較秸稈不還田處理產(chǎn)量提高了4.0%。秸稈還田后施用不同的復(fù)合菌系對產(chǎn)量產(chǎn)生了不同的影響，施用復(fù)合菌系B2+F5+F12的處理產(chǎn)量最高，達到9205 kg/hm2，與秸稈還田不施菌劑相比產(chǎn)量提高了6.3%；施用復(fù)合菌系B2+F12、F1+F5+F12的處理與秸稈還田不施菌劑相比產(chǎn)量分別提高了2.6%和0.5%。分析水稻的產(chǎn)量構(gòu)成，秸稈還田處理的有效穗數(shù)和結(jié)實率比秸稈不還田處理分別高8.2%和0.9%；秸稈還田后施用復(fù)合菌系B2+F5+F12與秸稈還田不施菌劑相比，有效穗數(shù)、結(jié)實率和千粒重分別增加6.0%、0.7%、1.3%。

圖4 施用不同復(fù)合菌系后水稻的株高和分蘗數(shù)Fig. 4 Plant height and tiller number as affected by different complex microbial agents

表4 復(fù)合菌系對水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成的影響Table 4 Effects of complex microbial agents on rice yield and its compositions

3 討論

水稻秸稈是重要的農(nóng)業(yè)廢棄資源，秸稈還田是將秸稈資源化應(yīng)用的重要方向。當(dāng)前我國秸稈還田利用率一直處于較低水平，主要原因在于秸稈還田后降解較慢，養(yǎng)分釋放速率無法滿足作物需求，并且會妨礙下茬作物的生長[36]。秸稈還田后配施降解菌劑能夠加速秸稈的降解，從而緩解秸稈還田利用的負面效應(yīng)。李靜等[32]篩選到的細菌菌株116和174對玉米秸稈的降解率分別為21.1%和18.4%，于慧娟等[37]篩選到的真菌菌株2-2和m-2對小麥秸稈的降解率分別為31%和29%，張冬雪等[13]篩選到的真菌菌株WAF6對水稻秸稈的降解率為45.7%。本研究采用多重指標(biāo)評價法篩選獲得的真菌F1、F5和F12對水稻秸稈的降解率分別為23.6%、25.3%、29.1%，細菌B2、B5和B6的水稻秸稈降解率分別為19.8%、20.4%、20.9%。篩選獲得的單菌株在實驗室條件下對水稻秸稈表現(xiàn)出較好的降解效果。

復(fù)合菌系的構(gòu)建及其在促進水稻秸稈快速腐解方面的研究，張?zhí)N琦等[38]構(gòu)建的復(fù)合菌系1和菌系3經(jīng)過7天的培養(yǎng)，對水稻秸稈的降解率分別為39.3%和31.0%；朱虹等[39]構(gòu)建的復(fù)合菌系腐解12天后，對水稻秸稈的降解率為41.4%。本研究根據(jù)各單菌株的濾紙條崩解能力、對水稻秸稈的降解能力及拮抗試驗結(jié)果，構(gòu)建了7組復(fù)合菌系，分別命名為復(fù)合菌系 a (F5+F12)、b (B2+F12)、c (F1+F5+F12)、d(B2+F5+F12)、e (B2+B5+B6)、f (B6+F1)、g(B6+F5)，其中復(fù)合菌系d在秸稈液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)15天后，對水稻秸稈的降解率最高為40.3%，與單株菌中降解率最高的菌株相比，降解率提高了11.2個百分點。所以本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系d對水稻秸稈的降解效果與同類研究相比表現(xiàn)出較高水平，在水稻秸稈降解方面有很好的應(yīng)用潛力。

秸稈原位還田配施降解菌劑能促進水稻秸稈快速腐解的相關(guān)研究，陳銀建等[40]報道的腐解菌劑在處理100天時對水稻秸稈的降解率達到50.5%，黃亞麗等[41]報道的降解菌劑在45天時對玉米秸稈的降解率達到56.7%，關(guān)法春等[42]報道的生物菌劑在水稻秸稈堆腐5個月后，降解率達到58.3%。本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系d在5個月的田間試驗中，對水稻秸稈的降解率最高為67.5%，而未施用菌劑的處理秸稈降解率為30.4%，施用菌劑后降解率提高了37.1個百分點，所以復(fù)合菌系d表現(xiàn)出更好的秸稈降解能力。

秸稈還田后，通過改善土壤物理化學(xué)性質(zhì)、提高土壤有益微生物數(shù)量以及促進土壤酶活性，進而改善土壤環(huán)境，改良土壤耕作性能，在收獲后的短時間內(nèi)恢復(fù)土壤穩(wěn)態(tài)，從而提高下一季作物的產(chǎn)量。李學(xué)初等[43]研究報道，在雙季稻種植體系中早稻秸稈還田可使晚稻增產(chǎn)144.0～418.5 kg/hm2，配施腐熟菌劑后產(chǎn)量可進一步提高78.0～274.5 kg/hm2，增產(chǎn)效果十分明顯。而關(guān)于秸稈還田配施腐解菌劑改善土壤養(yǎng)分狀況，穩(wěn)定和提高土壤有機質(zhì)含量以及促進水稻增產(chǎn)的相關(guān)報道，劉爽[44]研究發(fā)現(xiàn)，水稻秸稈配施組合菌有利于土壤有機質(zhì)、腐殖質(zhì)含量的增加，速效磷和速效鉀含量也有不同程度的提高。楊懷玉等[36]發(fā)現(xiàn)秸稈還田配施腐解菌劑能顯著提高土壤有機質(zhì)、速效鉀和速效磷含量，朱壩墩南地區(qū)秸稈還田配施腐解菌劑有機質(zhì)提高1.6 g/kg、速效鉀提高8.7 mg/kg、速效磷提高0.8 mg/kg。本研究中秸稈還田配施復(fù)合菌系d與秸稈還田不施菌劑處理相比，有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別增加2.1 g/kg、1.9 mg/kg、0.6 mg/kg、1.7 mg/kg，尤其是土壤有機質(zhì)在北方冷涼條件下提高幅度達到10.0%以上。李慶康等[45]報道水稻秸稈還田配施不同的腐解菌劑后水稻有效穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重都有顯著提高，進而提高水稻產(chǎn)量。本研究秸稈還田配施復(fù)合菌系d與秸稈還田不施菌劑相比，增加了水稻有效穗數(shù)、結(jié)實率和千粒重，增加幅度分別為6.0%、0.7%和1.3%，產(chǎn)量提高了6.3%，與楊懷玉等[36]、耿麗平等[46]的研究結(jié)果一致。秸稈還田配施降解菌劑能夠促進秸稈快速腐解、增加土壤有機質(zhì)含量，改善土壤養(yǎng)分狀況，進而提高水稻產(chǎn)量，是實現(xiàn)秸稈還田、保護黑土地可持續(xù)利用較為有效的措施。

4 結(jié)論

我們從稻田土壤中分離篩選的菌株經(jīng)過純化和復(fù)配取得了良好的分解水稻秸稈的效果，特別是3個菌株的復(fù)合菌系B2+F5+F12，與未施用菌劑相比，水稻秸稈降解率提高了37.1個百分點，土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別增加了2.1 g/kg、1.9 mg/kg、0.6 mg/kg、1.7 mg/kg，水稻產(chǎn)量提高了6.3%。