蒲地藍(lán)消炎口服液及純化水中洋蔥伯克霍爾德菌檢查方法的研究

楊學(xué)芳 蔡蓉

（濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰興 225441）

蒲地藍(lán)消炎口服液是由蒲公英、苦地丁、板藍(lán)根、黃芩四味中藥配伍，經(jīng)提取、配制而成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒，消腫利咽的功效，主要用于癤腫、腮腺炎、咽炎、扁桃體炎的治療[1，2]。近年研究表明，蒲地藍(lán)消炎口服液治療小兒手足口病[3]、急性上呼吸道感染[4]、口腔潰瘍[5]、皰疹咽炎[6]等效果明顯。王偉偉等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蒲地藍(lán)消炎口服液聯(lián)合奧司他韋治療小兒病毒性肺炎療效較好；趙東鐸[8]研究則表明，利用標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法+蒲地藍(lán)消炎口服液治療幽門(mén)螺桿菌感染性胃炎的療效及安全性均良好?？梢?jiàn)，蒲地藍(lán)消炎口服液在消炎、抗病毒方面效果突出。

蒲地藍(lán)消炎口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，依據(jù)藥典制劑通則，分別對(duì)總菌及控制菌（大腸埃希菌）進(jìn)行了控制，滿足了《中華人民共和國(guó)藥典》（簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》對(duì)微生物限度控制的基本要求。但對(duì)非無(wú)菌藥品而言，尤其是水制劑，未對(duì)其他潛在的微生物做進(jìn)一步的研究。洋蔥伯克霍爾德菌（Bcc.）（即為水制劑產(chǎn)品中具有潛在危害的一類微生物，目前被定義為不可接受微生物，其耐受消毒劑和抗生素，并能在水基質(zhì)的非無(wú)菌藥品中能夠存活甚至繁殖，尤其對(duì)免疫力缺失或低下的用藥人群存在較高的健康風(fēng)險(xiǎn)[9]。美國(guó)FDA 從2017 年就發(fā)布通知，建議制藥企業(yè)關(guān)注在非無(wú)菌水基質(zhì)藥品中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌群的污染風(fēng)險(xiǎn)。而我國(guó)，也曾屢次出現(xiàn)過(guò)因洋蔥伯克霍爾德菌引起的感染病例[10，11]，并有研究報(bào)道了其耐藥性分布情況[12-14]，正是由于其在重癥監(jiān)護(hù)室的感染率逐漸上升以及強(qiáng)大的耐藥性，引起了人們的高度重視。

美國(guó)藥典USP 中明確指出，用于吸入或口服、口服黏膜、皮膚或鼻腔使用的含水制劑需要檢查是否含有洋蔥伯克霍爾德菌[15]。對(duì)于中藥液體制劑而言，因其含水量高容易助長(zhǎng)微生物的生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致霉變、酸敗等現(xiàn)象，嚴(yán)重者則造成藥物的安全性問(wèn)題[16]，故應(yīng)加強(qiáng)微生物指標(biāo)控制。本研究旨在建立蒲地藍(lán)消炎口服液及其制藥用水（純化水）中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查方法，以此來(lái)加強(qiáng)從源頭到成品的整體控制，降低致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)，提升產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，保障公眾用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HR1200-ⅡB2 生物安全柜（青島海爾）；BSC-1000ⅡB2 生物安全柜（蘇凈安泰）；HPX-Ⅱ-400 生化培養(yǎng)箱、SPX-400-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)）；ASM-0.6安瓿水浴滅菌器（山東新華）。

1.2 試劑與藥品 洋蔥伯克霍爾德菌（菌株編號(hào)：ATCC25416），來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心；蒲地藍(lán)消炎口服液（批號(hào)：2011126，10 mL/ 支）和純化水（批號(hào)：210223），均為濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司自制；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（德國(guó)默克）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（德國(guó)默克）；洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BCSA，北京三藥）；BCSA 選擇性添加劑（北京三藥）；pH7.0 無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液（青島海博）；麥?zhǔn)媳葷峁埽◤V東環(huán)凱）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 接種洋蔥伯克霍爾德菌至10 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)45 h。取上述培養(yǎng)物用麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷岽_定濃度，再用pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液10 倍系列稀釋至約1～100 cfu/mL。取含菌量1～100 cfu/mL 洋蔥伯克霍爾德菌懸液1 mL 至2個(gè)平皿中，加胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基并搖勻，30 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌液制備菌種計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 供試品溶液制備 取供試品（蒲地藍(lán)消炎口服液、純化水）10 mL，加pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液90 mL，制成1∶10 的供試液。

2.3 檢查方法 取1∶10 的供試液，采用平皿法進(jìn)行洋蔥伯克霍爾德菌檢查。

2.4 方法適用性試驗(yàn)

2.4.1 供試品組 取1∶10 的供試液10 mL，接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 培養(yǎng)基中加入1 支BCSA選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.2 陽(yáng)性對(duì)照組 取1∶10 的供試液10 mL 及1～100 cfu/mL 的洋蔥伯克霍爾德菌懸液1 mL，接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 培養(yǎng)基中加入1 支BCSA 選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.3 陰性對(duì)照組 取pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液10 mL，接種至100 mL 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（每500 mL 加入1 支BCSA 選擇性添加劑）平板上，置32.5 ℃培養(yǎng)48 h。

2.4.4 結(jié)果判斷 若洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判定為未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。若洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，且為周圍黃色的綠棕色菌落，或者周圍粉紅色的白色菌落，則應(yīng)進(jìn)行分離、純化、鏡檢鑒定，確認(rèn)是否為洋蔥伯克霍爾德菌。

若陽(yáng)性對(duì)照組檢出洋蔥伯克霍爾德菌，供試品組和陰性對(duì)照組未檢出洋蔥伯克霍爾德菌，則不可接受微生物（洋蔥伯克霍爾德菌）驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果符合要求。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖1。

表2 蒲地藍(lán)消炎口服液驗(yàn)證結(jié)果

表3 純化水驗(yàn)證結(jié)果

圖1 驗(yàn)證結(jié)果

2.5 結(jié)論 陽(yáng)性對(duì)照組檢出洋蔥伯克霍爾德菌，供試品組和陰性對(duì)照組未檢出洋蔥伯克霍爾德菌，不可接受微生物驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果符合要求。該方法可用于蒲地藍(lán)消炎口服液及純化水中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查。

3 討論

采用涂布法對(duì)洋蔥伯克霍爾德選擇性瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BCSA）進(jìn)行了適用性檢查。選取洋蔥伯克霍爾德菌（ATCC25416）、新洋蔥伯克霍爾德菌（BNCC331058）、多噬伯克霍爾德菌（BNCC301368）進(jìn)行了BCSA 促生長(zhǎng)能力及指示特性檢查；選取金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）進(jìn)行了BCSA 抑制能力檢查。培養(yǎng)結(jié)果顯示，BCSA 對(duì)洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌、多噬伯克霍爾德菌有促生長(zhǎng)作用，而對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌有抑制能力，空白對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，BCSA 適用性檢查符合規(guī)定。

取公司自制蒲地藍(lán)消炎口服液3 批、純化水3 批，采用文中經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的方法進(jìn)行檢查，結(jié)果：每1 mL 蒲地藍(lán)消炎口服液菌未檢出洋蔥伯克霍爾德菌；每1 mL 純化水未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。

蒲地藍(lán)消炎口服液自2015 年便收錄于《中國(guó)藥典》中。該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，在理化方面，針對(duì)處方藥材分別建立了3 個(gè)定性及2 個(gè)定量成分的研究。在微生物方面，目前僅滿足中國(guó)藥典中對(duì)口服給藥液體制劑的基本要求，即《中國(guó)藥典》中對(duì)總菌及控制菌的基本要求。洋蔥伯克霍爾德菌，作為新出現(xiàn)的一種條件致病菌，污染廣，危害大，可考慮將其納入蒲地藍(lán)消炎口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，并納入公司純化水控制標(biāo)準(zhǔn)中，進(jìn)而從源頭保障其他水制劑產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

綜上所述，文中建立的檢查方法，不僅可以用于蒲地藍(lán)消炎口服液及純化水中不可接受微生物洋蔥伯克霍爾德菌的檢查，也可以參考應(yīng)用到其他水制劑產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和安全控制中，對(duì)于提升整體藥品的安全性，有較大的借鑒意義。