生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)黑土中阿特拉津消減及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

姜 昭，馬月璇，閆軼文，王建民，劉 暢，佟姍姍，張智偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

阿特拉津作為一種三嗪類(lèi)內(nèi)吸選擇性苗前、苗后封閉除草劑，在世界范圍內(nèi)玉米種植過(guò)程中廣泛使用[1]。其對(duì)一年生禾本科和闊葉雜草以及多年生雜草具有較好防除效果。然而，阿特拉津同樣具有明顯的生物毒性。因此，長(zhǎng)期攝入阿特拉津會(huì)損害動(dòng)物或人體健康[2]。此外，由于阿特拉津具有長(zhǎng)殘留特性，進(jìn)入環(huán)境后可在土壤及水體中殘留并積累，進(jìn)而對(duì)水生生物、敏感植物及土壤微生物造成負(fù)面影響[3-5]。由此可見(jiàn)，關(guān)注阿特拉津使用而產(chǎn)生的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)并采用必要措施消減其在環(huán)境中殘留尤為必要。

微生物修復(fù)技術(shù)被認(rèn)為是一種高效、綠色的消減環(huán)境中有機(jī)污染物的技術(shù)方法。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，已從世界范圍環(huán)境樣品中分離得到不同生長(zhǎng)特性阿特拉津降解微生物[6]。然而，目前大多在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下研究降解微生物對(duì)土壤中阿特拉津的去除效果，如何在田間原位條件下利用降解菌株消減農(nóng)田土壤中殘留的阿特拉津仍需探討[7-8]。以功能微生物與有機(jī)肥為主要成分制備而成的生物有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其在調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)、控制土傳病害等方面具有明顯作用效果。凌寧等利用多粘芽孢桿菌、綠色木霉等拮抗菌株與豬糞堆肥為主要成分制備西瓜專(zhuān)用生物有機(jī)肥，有效實(shí)現(xiàn)防治西瓜枯萎病[9]。侯宗海通過(guò)基施生物有機(jī)肥，使小白菜株高、最大葉片寬明顯增加，同時(shí)提升小白菜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累及單株鮮重[10]。然而，利用生物有機(jī)肥提升農(nóng)田土壤中有機(jī)污染物消減的研究則相對(duì)較少[11-13]。

東北黑土區(qū)作為我國(guó)重要商品糧生產(chǎn)基地，在維持國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮重要作用。然而該地區(qū)由于長(zhǎng)期過(guò)度墾殖和不合理經(jīng)營(yíng)的管理方式，導(dǎo)致黑土出現(xiàn)質(zhì)量退化及生產(chǎn)力下降等問(wèn)題[14]，如何在保障東北黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模與生產(chǎn)過(guò)程前提下，開(kāi)展農(nóng)田污染土壤修復(fù)與質(zhì)量提升值得關(guān)注。研究表明，增加有機(jī)肥施用是改善土壤質(zhì)量的有效措施，同時(shí)有機(jī)肥添加亦可調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，強(qiáng)化土壤中各類(lèi)物質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化過(guò)程[15-16]。為此，研究選取本課題組研發(fā)的具有阿特拉津消減功能的生物有機(jī)肥（DNBF32）為供試材料，重點(diǎn)分析其去除農(nóng)田土壤中殘留阿特拉津及調(diào)節(jié)玉米生長(zhǎng)的作用效果，同時(shí)研究DNBF32對(duì)玉米田土壤中細(xì)菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)調(diào)控效果，旨在進(jìn)一步探討DNBF32消減阿特拉津與調(diào)節(jié)玉米生長(zhǎng)的微生物學(xué)機(jī)制，相關(guān)研究可為生物有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

田間試驗(yàn)在黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)舍利屯玉米農(nóng)田開(kāi)展。土壤類(lèi)型為黑鈣土，土壤基本性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)37.23 g·kg-1，全氮1.13 g·kg-1，全磷0.58 g·kg-1，全鉀18.35 g·kg-1，速效磷39.53 mg·kg-1，堿解氮68.81 mg·kg-1，速效鉀134.00 mg·kg-1，pH 6.12。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)置4種不同生物有機(jī)肥施用量處理，施用量分別為0 kg·hm-2（CK）、75 kg·hm-2（SF75）、150 kg·hm-2（SF150）和225 kg·hm-2（SF225）。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。開(kāi)展田間小區(qū)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)面積約104 m2（壟長(zhǎng)約20 m，壟數(shù)為9壟，壟距為0.65 m）。種植玉米品種為綏玉18，種植模式為傳統(tǒng)壟作，種植密度約為67 500株·hm-2?；蕿橄灿颰M玉米專(zhuān)用復(fù)合肥（總養(yǎng)分≥52%，N-28，P2O5-14，K2O-10），基肥施用量折合純氮（N）為180 kg·hm-2。DNBF32以追肥形式在上述試驗(yàn)田玉米封壟前（6月中旬）施用。DNBF32為黑龍江省土壤保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研制的固態(tài)生物有機(jī)肥，其固態(tài)基質(zhì)為畜禽糞便堆肥、腐殖酸和草炭。活性微生物菌株為可降解阿特拉津功能菌株Acinetobactersp.DNS32，有效活菌數(shù)不低于0.2×108CFU·g-1。DNBF32主要養(yǎng)分含量為：總氮（TN）1.23%、總磷（TP）1.03%、總鉀（TK）1.66%、有機(jī)質(zhì)46.7%。

1.3 樣品采集

分別于玉米播種前（5月）、玉米大喇叭口（7月）和成熟期（10月）采用蛇形取樣法利用土鉆采集表層0～20 cm土壤。將采集土壤樣品裝入自封袋迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，分析土壤生物學(xué)特征及測(cè)定阿特拉津濃度，并于成熟期考種測(cè)產(chǎn)。此外，本試驗(yàn)于玉米播種前（5月初，基肥以及除草劑均已投加）隨機(jī)采集試驗(yàn)區(qū)域土壤樣品代表試驗(yàn)前土壤（YS），樣品采集方式同上所述。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 土壤中阿特拉津殘留濃度測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g風(fēng)干土壤樣品到100 mL三角瓶。利用甲醇-水為9∶1（體積比）溶液提取土壤中阿特拉津，并利用氣相色譜儀（GC-2014，島津，日本）測(cè)定阿特拉津含量[17]。

1.4.2 玉米生長(zhǎng)及產(chǎn)量測(cè)定方法

成熟期測(cè)定各小區(qū)玉米行距及株距，計(jì)算株數(shù)和穗數(shù)[18]。隨機(jī)選取20株玉米測(cè)定玉米株高、千粒重、穗粒數(shù)并計(jì)算玉米產(chǎn)量。

1.4.3 土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定

可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定采用張麗娟等方法[19]。稱(chēng)取10 g新鮮土壤樣品置于裝有90 mL滅菌蒸餾水的三角瓶中。置于恒溫震蕩器中搖勻處理30 min后靜置。取1 mL上清液置于裝有9 mL滅菌水的試管中，記作10-1稀釋梯度菌懸液，并逐級(jí)稀釋至10-6稀釋度菌懸液備用。各稀釋度菌懸液中可培養(yǎng)細(xì)菌群落總數(shù)采用平板技術(shù)法測(cè)定。吸取1mL菌懸液于LB培養(yǎng)基平板上，在無(wú)菌條件下涂布均勻后置于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)（1～2 d），按下列公式統(tǒng)計(jì)各處理可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)。

式中，A-每克干土含有可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)（CFU·g-1）干土；C-同一稀釋度平均菌落數(shù)（CFU）；n-稀釋倍數(shù)；M-新鮮土壤質(zhì)量（g）；T-土壤含水率（%）。

1.4.4 微生物群落測(cè)定方法

借助土壤微生物總DNA提取試劑盒獲取供試樣品DNA。對(duì)土壤中細(xì)菌16S rDNA基因序列V4～V5區(qū)作擴(kuò)增。樣品經(jīng)純化處理后利用Ⅰllumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)作生物信息學(xué)分析，明確各試驗(yàn)處理微生物群落特征差異情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 19.0。不同處理間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析采用單因素方法作分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)農(nóng)田土壤中阿特拉津的消減

表1中數(shù)據(jù)表明，阿特拉津噴施后，試驗(yàn)區(qū)表層土壤中（YS）阿特拉津檢測(cè)濃度為（1.48±0.32）mg·kg-1。本研究發(fā)現(xiàn)阿特拉津存在自然降解趨勢(shì)，在玉米成熟期CK處理土壤中阿特拉津殘留濃度為（0.73±0.18）mg·kg-1，顯著低于YS土壤樣品。DNBF32施用可減少玉米田阿特拉津殘留濃度。在玉米大喇叭口期和成熟期采集樣品中，隨施用量增加，阿特拉津殘留濃度顯著下降。其中，在玉米成熟期時(shí)，SF150與SF225處理中已無(wú)阿特拉津檢出。

表1 生物有機(jī)肥DNBF32施用對(duì)土壤中阿特拉津殘留量的影響Table 1 Effects of microbial organic fertilizer DNBF32 on atrazine residue in soil

2.2 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響

表2中結(jié)果表明，DNBF32施用處理（SF75、SF150和SF225）玉米株高均高于未施用DNBF32對(duì)照處理（CK），說(shuō)明DNBF32施用對(duì)玉米生長(zhǎng)具有一定調(diào)節(jié)作用。此外，盡管DNBF32施用可提高玉米千粒重和產(chǎn)量，但與CK處理相比未達(dá)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)合DNBF32對(duì)農(nóng)田土壤中阿特拉津去除效果，同時(shí)對(duì)比上述各施用量DNBF32對(duì)玉米生長(zhǎng)性狀（株高和千粒重）和產(chǎn)量的調(diào)控作用效果，當(dāng)DNBF32施用量為150 kg·hm-2時(shí)，有助于較好協(xié)同實(shí)現(xiàn)阿特拉津消減與作物生長(zhǎng)調(diào)控。

表2 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)玉米生長(zhǎng)性狀及產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of biological organic fertilizer DNBF32 on growth characters and yield of maize

2.3 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)玉米田土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)的影響

不同施用量生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)玉米田土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)影響如圖1所示。玉米成熟期土壤樣品（CK）與播種前土壤樣品中（YS）可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)無(wú)顯著差異，說(shuō)明季節(jié)變化與玉米種植對(duì)農(nóng)田土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)影響不顯著。此外，隨DNBF32施用量逐漸增加，土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)顯著增加（P＜0.05）。

圖1 生物有機(jī)肥DNBF32施用對(duì)玉米田土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of DNBF32 application on the total number of culturable bacterial colonies in maize field soil

2.3.2 生物有機(jī)肥DNBF32對(duì)玉米田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

不同生物有機(jī)肥（DNBF32）施用量條件下各處理土壤樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)如表3所示。由表3可知，生物有機(jī)肥施用可改變土壤細(xì)菌群落多樣性。SF150和SF225處理的Ace多樣性指數(shù)和Chao多樣性指數(shù)均明顯高于其他處理，說(shuō)明上述施用量的DNBF32對(duì)于土壤細(xì)菌多樣性具有一定調(diào)節(jié)作用。

表3 生物有機(jī)肥施用條件下土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 3 Soil bacterial diversity index under different bioorganic fertilizer application conditions

不同處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCoA分析結(jié)果如圖2所示。成分1和成分2合計(jì)可解釋80.61%總體變量，說(shuō)明上述兩個(gè)成分可反映各處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息。生物有機(jī)肥施用量處理樣點(diǎn)（SF75、SF150和SF225）位于成分2正半軸區(qū)域，而未施肥處理2個(gè)樣點(diǎn)（YS和CK）位于主成分2負(fù)半軸，表明生物有機(jī)肥施用明顯改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。另外，SF150與SF75和SF225處理在圖2中位置存在差異，說(shuō)明不同施用量DNBF32對(duì)玉米田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)作用存在差異。

圖2 不同處理土壤樣品細(xì)菌群落多樣性PCoA分析Fig.2 PCoA analysis of bacterial community diversity of soil samples treated with different treatments

結(jié)合上述研究結(jié)果，由于SF150處理表現(xiàn)出較低的阿特拉津殘留濃度與玉米生長(zhǎng)狀態(tài)，因此本研究借助Venn分析進(jìn)一步研究SF150處理中獨(dú)特存在的微生物種類(lèi)及潛在功能。圖3表明，與其他處理相比，SF150處理中有12個(gè)獨(dú)有OTU，其中包括Chloroflexi菌屬（可利用光能進(jìn)行合成作用）[20]、Terrimonas菌屬（具有對(duì)污染物菲降解的能力）[21]、Rhodospirillales菌目（具有產(chǎn)生乙酸及光合產(chǎn)能的能力）[22]?？梢?jiàn)，適宜施用水平的DNBF32可在一定程度上調(diào)節(jié)玉米農(nóng)田中功能微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 不同處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Venn分析Fig.3 Venn analysis of microbial community structure under different bioorganic fertilizer application conditions

2.4 相關(guān)性分析

表4為本研究所涉及主要指標(biāo)相關(guān)性分析。結(jié)果表明，有機(jī)肥施用量與土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)及細(xì)菌多樣性指數(shù)（Chao指數(shù)）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。有機(jī)肥施用量與阿特拉津殘留濃度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明有機(jī)肥施用有助于強(qiáng)化土壤中阿特拉津消減。此外，玉米田土壤中阿特拉津殘留濃度與可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)和細(xì)菌多樣性指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。玉米產(chǎn)量與細(xì)菌多樣性指數(shù)呈正相關(guān)，且與阿特拉津殘留量呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)均相對(duì)較低。

表4 研究指標(biāo)相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of the researched indices

3 討論

生物有機(jī)肥是將功能微生物與傳統(tǒng)有機(jī)肥充分結(jié)合而形成具有特殊功能的肥料，其在具備傳統(tǒng)有機(jī)肥料植物促生功能外，也因其特殊功能，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等方面受到廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期研究利用除草劑阿特拉津高效降解菌DNS32與牛糞堆肥等固體基質(zhì)制備可強(qiáng)化阿特拉津消減的生物有機(jī)肥DNBF32。本研究進(jìn)一步證實(shí)生物有機(jī)肥DNBF32在農(nóng)田原位施用條件下（150和225 kg·hm-2）可使成熟期玉米農(nóng)田土壤中無(wú)阿特拉津檢出（見(jiàn)表1），說(shuō)明DNBF32在農(nóng)田原位條件下也具有較好強(qiáng)化阿特拉津消減的能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)施用量為150 kg·hm-2的DNBF32可使玉米株高和產(chǎn)量較對(duì)照處理分別提高7.64%和8.30%，說(shuō)明DNBF32還可在一定程度上提高玉米千粒重和產(chǎn)量，調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)。上述研究結(jié)果為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)同時(shí)，同步實(shí)現(xiàn)農(nóng)田除草劑原位強(qiáng)化消減提出新嘗試。

微生物在土壤物質(zhì)循環(huán)與生態(tài)功能維持方面發(fā)揮重要作用。包括有機(jī)肥在內(nèi)的外源物質(zhì)對(duì)于土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為是強(qiáng)化土壤生態(tài)功能重要途徑。朱菲瑩等研究發(fā)現(xiàn)，施用生物有機(jī)肥可使土壤細(xì)菌群落多樣性較對(duì)照土壤相比略有增加，同時(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)變化有助于減緩西瓜枯萎病發(fā)生[23]。本研究發(fā)現(xiàn)DNBF32施用可使成熟期玉米土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)顯著增加（見(jiàn)圖1），同時(shí)結(jié)合DNBF32施用處理（150和225 kg·hm-2）Ace多樣性指數(shù)和Chao多樣性指數(shù)均明顯高于其他處理（見(jiàn)表3），說(shuō)明DNBF32對(duì)土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)與細(xì)菌群落多樣性具有明顯正向調(diào)節(jié)作用。此外，基于韋恩圖分析結(jié)果表明，與其他處理相比，代表Chloroflexi菌屬、Terrimonas菌屬等系列功能微生物的OTU僅在DNBF32施用量為150 kg·hm-2處理中發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明DNBF32施用有助于豐富或活化玉米田土壤生態(tài)功能（見(jiàn)圖3）。劉艷霞等研究發(fā)現(xiàn)，抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥田間施用處理較對(duì)照處理相比細(xì)菌種類(lèi)有所增加，顯著提高拮抗菌數(shù)并提升土壤微生物群落功能多樣性[24]。齊建超等發(fā)現(xiàn)，微生物菌劑與有機(jī)肥聯(lián)合作用可使土壤微生物數(shù)量增加，多樣性更為豐富，最終促進(jìn)土壤中石油烴降解[25]。上述研究結(jié)果表明，生物有機(jī)肥調(diào)節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是發(fā)揮其生態(tài)功能（污染物降解、土傳病害防控等）重要途徑。相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步表明，有機(jī)肥施用量與土壤可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)及細(xì)菌多樣性指數(shù)（Chao指數(shù)）呈正相關(guān)，同時(shí)玉米田土壤中阿特拉津殘留濃度與可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)和細(xì)菌多樣性指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明DNBF32施用可通過(guò)調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)強(qiáng)化阿特拉津消減。此外，盡管玉米產(chǎn)量與細(xì)菌多樣性指數(shù)呈正相關(guān)，與阿特拉津殘留量呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)均相對(duì)較低且與有機(jī)肥施用量無(wú)明顯相關(guān)性。主要是由于本研究中DNBF32施用以消減除草劑阿特拉津?yàn)橹饕繕?biāo)，同時(shí)結(jié)合玉米生產(chǎn)的農(nóng)藝措施而以追肥方式施用，因此其對(duì)玉米生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用并未達(dá)顯著差異水平，但仍能表現(xiàn)出一定程度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用。綜上所述，DNBF32通過(guò)調(diào)控土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)強(qiáng)化除草劑阿特拉津消減，并對(duì)玉米產(chǎn)量也具有一定調(diào)節(jié)作用。此外，DNBF32對(duì)于土壤養(yǎng)分的調(diào)節(jié)作用在后續(xù)研究中仍需進(jìn)一步關(guān)注與探討。

4 結(jié) 論

生物有機(jī)肥DNBF32以追肥形式在田間施用可降低黑土區(qū)玉米田土壤中除草劑阿特拉津殘留濃度，且殘留濃度與DNBF32施用量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)施用量為150 kg·hm-2以上時(shí)玉米成熟期農(nóng)田土壤中無(wú)阿特拉津檢出。上述投加水平的DNBF32對(duì)玉米株高與產(chǎn)量也具有一定正向調(diào)節(jié)作用。此外，DNBF32施用可提升玉米田土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌菌落總數(shù)，調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌多樣性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。相關(guān)性分析進(jìn)一步說(shuō)明DNBF32施用可通過(guò)調(diào)節(jié)土壤細(xì)菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)進(jìn)一步強(qiáng)化阿特拉津消減。