無曲液態(tài)米酒釀酒酵母篩選

鄭瑞龍，楊傳佳，鈕成拓，鄭飛云，王金晶，李 崎，劉春鳳*

（1.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江南大學(xué)），江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

米酒是以糯米為主要原料，經(jīng)液化、糖化、發(fā)酵釀造而成[1]。我國(guó)糯米釀酒歷史悠久。傳統(tǒng)米酒多為固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)浸米、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、澄清、煎酒、陳化、勾兌等步驟，采用“酒曲復(fù)式發(fā)酵法”[2]。一般認(rèn)為，米曲是米酒釀造過程中重要微生物來源，可為米酒釀造過程提供淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等豐富酶系，但傳統(tǒng)米酒生產(chǎn)工藝效率較低，能耗較高，浸米廢水對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，且無法保障米酒批間風(fēng)味穩(wěn)定性[3]。如今，酶制劑在釀造業(yè)應(yīng)用廣泛，盛鳳云等利用高溫淀粉酶將粉碎原料粉碎后液化，取代傳統(tǒng)工藝中的浸米和蒸米，并初步估算能量，可節(jié)省50%以上[4]。張敏將酶法液化的糯米粉進(jìn)一步添加糖化酶和麥曲進(jìn)行多酶釀造米酒[5]。但目前液態(tài)發(fā)酵米酒多為酒曲與酶制劑協(xié)同作用，中國(guó)釀酒協(xié)會(huì)曾提出從傳統(tǒng)雙邊發(fā)酵改為先糖化后發(fā)酵的清液發(fā)酵技術(shù)可行[6]。與傳統(tǒng)發(fā)酵米酒（曲和酵母聯(lián)合處理）相比，使用酶法液化制備糯米糖液，接種純種酵母液態(tài)米酒，使米酒產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)更可控，并且可以提高勞動(dòng)生產(chǎn)率和機(jī)械水平，有利于現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

酵母性能優(yōu)劣不僅決定米酒釀造效率，還影響米酒風(fēng)味品質(zhì)[7-8]。我國(guó)傳統(tǒng)米酒酒曲中含有多種微生物，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酒曲中主要產(chǎn)酒精功能菌，對(duì)米酒質(zhì)量和發(fā)酵效率有較大影響[9-10]。酒曲中酵母包括酵母屬、假絲酵母屬、復(fù)膜孢酵母屬和畢赤酵母屬等[2]，目前對(duì)適用于米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母研究較為缺乏。伍保龍等從米酒酒曲中分離得到產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的釀酒酵母，但并未對(duì)其風(fēng)味進(jìn)行分析及米酒純種發(fā)酵[11]。鄒凌波使用從酒曲和米酒醪中分離得到的釀酒酵母協(xié)同糖化酶進(jìn)行雙邊發(fā)酵[12]。對(duì)于適用于純液態(tài)發(fā)酵的釀酒酵母篩選應(yīng)用仍鮮有報(bào)道，菌株多樣化為釀造酒生產(chǎn)提供豐富多樣性[13]，篩選適用于液態(tài)米酒純種發(fā)酵的釀酒酵母具有重要價(jià)值與意義。為此，本研究以分離自米曲樣品中潛在釀酒酵母和實(shí)驗(yàn)室保藏共計(jì)198株菌株為研究對(duì)象，測(cè)定其產(chǎn)氣能力、乙醇生產(chǎn)能力和發(fā)酵速率等，并分析菌株發(fā)酵所得米酒理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其香氣貢獻(xiàn)，最終得到具有優(yōu)良潛力的釀酒酵母。該研究對(duì)純種發(fā)酵液態(tài)米酒開發(fā)具有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米購(gòu)置于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；米曲購(gòu)自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū)；菌株YSHJ為上海某酒廠提供，應(yīng)用于米酒發(fā)酵，為釀酒酵母屬。有機(jī)酸、揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司；試驗(yàn)藥品均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：用于酵母培養(yǎng)，主要成分包括葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，瓊脂粉20 g（用于固體培養(yǎng)基），蒸餾水1 000 mL，115℃滅菌15 min；

商業(yè)Biggy agar培養(yǎng)基：由青島海博生物技術(shù)有限公司提供；

TTC底層培養(yǎng)基：葡萄糖50.5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏7.5 g，酸性磷酸鉀5 g，硫酸鎂2 g，檸檬酸1.35 g，瓊脂30 g，115℃滅菌15 min，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素1.0 g；TTC上層培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖0.5 g，瓊脂15 g，115℃滅菌15 min，冷卻后加入TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）0.5 g。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌株分離

購(gòu)買來自四川、湖北、江西、廣西、云南、江蘇等地區(qū)12種米酒酒曲。分別取2 g酒曲樣品添加至含玻璃珠50 mL無菌生理鹽水中，25℃、180 r·min-1活化20 min后，將菌液稀釋涂布至添加含有1 g·L-1丙酸鈉、25 mg·L-1氨芐抗菌YPD固體平板中，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。挑選出具有形態(tài)圓形、表明光滑、邊緣整齊菌落，在YPD平板上作二次劃線分離，純化分離物接入YPD液體甘油管中于-80℃保存，并編號(hào)。

1.3.2 菌株起始發(fā)酵能力

將甘油管保藏菌株接種于YPD液體試管中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)活化2次后接種至糖度為11%含杜氏小管糯米汁培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)48 h，保留起酵速度快菌株用于下一級(jí)篩選。

1.3.3 菌株硫化氫生成能力

在YPD液體試管中活化起酵能力較好菌株，在Biggy agar平板上點(diǎn)樣5μL過夜培養(yǎng)物，28℃靜置培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落顏色選擇低產(chǎn)或不產(chǎn)硫化氫菌株用于下一級(jí)篩選（菌落顏色越淺，硫化氫生成能力越低）。

1.3.4 菌株乙醇生成能力

將以上篩選得到酵母菌株在YPD液體試管中活化，在TTC下層平板上點(diǎn)樣5μL，28℃培養(yǎng)24～48 h，倒入TTC上層培養(yǎng)基，28℃避光培養(yǎng)2～4 h，挑選菌落顏色較深，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)菌株。

1.3.5 糯米汁糖液制備

粉碎糯米按照料水質(zhì)量比1∶6，于50℃投料。添加高溫α-淀粉酶，升溫至95℃，保溫30 min，升溫至100℃，煮沸10 min；冷卻至50℃，按200 U·g-1糯米添加蛋白酶，保溫30 min；升溫至62℃，按180 U·g-1糯米添加糖化酶，保溫120 min；過濾后煮沸10 min。所得糯米糖液根據(jù)需要稀釋成目標(biāo)糖度，于高壓蒸汽滅菌鍋中105℃滅菌10 min。

1.3.6 液化法米酒發(fā)酵試驗(yàn)

在糯米汁中接種釀酒酵母菌株，以米酒酵母YSHJ為對(duì)照。

具體發(fā)酵方法為：糯米汁糖度16%，發(fā)酵規(guī)模500 mL，裝液量60%，發(fā)酵體系中酵母接種量為107cfu·mL-1，25℃發(fā)酵，并監(jiān)測(cè)其失重，直至24 h內(nèi)失重＜0.2 g·300 mL-1，發(fā)酵結(jié)束后離心過濾獲得米酒。每批次發(fā)酵設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行。

1.3.7 液化法米酒分析檢測(cè)

1.3.7.1 米酒理化指標(biāo)測(cè)定

米酒理化指標(biāo)分析過程參照黃酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[14]和《釀酒工業(yè)分析》[15]方法。

1.3.7.2 米酒有機(jī)酸含量測(cè)定

將酒樣適當(dāng)稀釋后，經(jīng)C18固相萃取柱過濾后用0.22μm水系濾膜過濾備用。

色譜條件：色譜柱Waters X select HSS T3（4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.02 mol·L-1（pH 2.5）磷酸二氫鉀緩沖液；流速：0.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫30℃。根據(jù)峰保留時(shí)間和其峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品比較，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線作定量測(cè)定。

1.3.7.3 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

通過SPME-GC-MS測(cè)定米酒中揮發(fā)性化合物，酒樣處理?xiàng)l件為：將8 mL酒樣加入20 mL潔凈螺口頂空瓶中，并加入2.0 g NaCl和2-辛醇內(nèi)標(biāo)（終濃度50μg·L-1）。45℃預(yù)熱5 min，萃取60 min。萃取結(jié)束后，將75μm Car/PDMS萃取頭插入進(jìn)樣口，250℃解吸附5 min。分析條件為：EG-20 m彈性石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 m×0.25μm；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL·min-1；升溫程序：從180℃開始，保持2 min，以3℃·min-1升溫到230℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250℃，出樣口溫度200℃；檢測(cè)電壓350 V。

MS條件：EⅠ離子源，發(fā)射電流200μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 U。未知化合物定性通過與NⅠST 05質(zhì)譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)確定，化合物定量通過在體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液中配制待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)定量化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值與定量化合物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定果酒中揮發(fā)性化合物濃度。

1.3.8 米酒感官品評(píng)

感官品評(píng)小組由2名具有專業(yè)品評(píng)經(jīng)驗(yàn)老師和8名經(jīng)酒類品評(píng)訓(xùn)練并選拔出的研究生組成，小組成員定期開展米酒感官品評(píng)訓(xùn)練后作為品評(píng)員完成感官品評(píng)。感官品評(píng)評(píng)分和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[2]。

表1 感官品評(píng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Organoleptic evaluation criteria

1.3.9 菌株18S rDNA鑒定

將甘油管保藏菌株于10 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1過夜活化，隨后轉(zhuǎn)接至10 mL YPD培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)18～24 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min（12 000 r·min-1），棄上清，采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA，選用酵母ⅠTS通用引物（ⅠTS1-F:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′;ⅠTS4-R:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）擴(kuò)增基因組DNA，測(cè)序PCR產(chǎn)物。采用BLAST方式將測(cè)定的18S rDNA序列與Gen-Bank中酵母菌序列作比對(duì)，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理與分析

研究使用GraphPad Prism 8.4.3繪圖，使用SPSS 26.0作顯著性、主成分等統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)為3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株篩選

試驗(yàn)從米曲樣品中分離得到菌株108株及實(shí)驗(yàn)室保藏菌株90株，共198株菌株用于下一步試驗(yàn)（見表2），表中短線以上數(shù)目為進(jìn)入下一篩選階段菌株個(gè)數(shù)。

表2 菌株篩選結(jié)果Table 2 Screening results of strains

對(duì)試驗(yàn)菌株作杜氏小管發(fā)酵試驗(yàn)，25℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。結(jié)果表明，57株氣體全部充滿杜氏小管且均有一定酒精感，47株氣體占杜氏小管2/3，該104株為起酵能力較優(yōu)菌株。酵母在發(fā)酵過程中伴隨含硫化合物合成而產(chǎn)生H2S，H2S揮發(fā)性較強(qiáng)，具有臭雞蛋不愉悅氣味。通過使用BⅠGGY瓊脂培養(yǎng)基顯色程度對(duì)杜氏小管篩選得到酵母產(chǎn)H2S能力作表征。其中29株菌株菌落為白色或黃色，認(rèn)為其低產(chǎn)硫化氫。進(jìn)一步通過TTC篩選平板，選擇菌落顏色深紅色產(chǎn)酒精能力強(qiáng)10株菌株開展后續(xù)研究。

調(diào)整糯米汁發(fā)酵培養(yǎng)基糖度為12%，接種10株菌株，并以米酒酵母YSHJ為對(duì)照，該菌株為酒廠提供，并已應(yīng)用于米酒生產(chǎn)。測(cè)定發(fā)酵速度與酒精度。各菌株發(fā)酵速率根據(jù)其CO2生成速度判斷，斜率越大則發(fā)酵速度越快，結(jié)果如圖1顯示，菌株21和26的CO2失重最高，分別為4.86和4.84 g。菌株13和40發(fā)酵速度最慢。所有菌株中，有7株菌株酒精度高于對(duì)照菌株。

圖1 不同菌株發(fā)酵性能Fig.1 Fermentation ability of different strains

2.2 米酒發(fā)酵

基于上述試驗(yàn)篩選得到7株發(fā)酵性能較為優(yōu)良菌株，開展米酒發(fā)酵試驗(yàn)，同時(shí)以米酒酵母YSHJ為對(duì)照組，發(fā)酵完成后，分析其基礎(chǔ)理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味化合物。

2.2.1 米酒理化指標(biāo)分析

米酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)如表3所示，除菌株30和127發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，12 d完成發(fā)酵，其余菌株發(fā)酵時(shí)間均為10 d。不同菌株發(fā)酵米酒酒精度為7.02%～7.19%V/V，無顯著差異，菌株21、30、184發(fā)酵米酒殘?zhí)歉哂趯?duì)照菌株YSHJ。相較于對(duì)照菌株，菌株26、89和167發(fā)酵米酒具有更高酒精度和更少殘?zhí)?，具有潛在發(fā)酵優(yōu)勢(shì)。除菌株21、26具有較高總酸含量外，其余菌株發(fā)酵米酒總酸含量低，適量酸可提高米酒品質(zhì)。菌株21、26、127和167所得米酒具有較高甘油含量，甘油是酵母酒精發(fā)酵過程中主要副產(chǎn)物之一，可為酒體提供圓潤(rùn)、柔滑口感，一定含量甘油可增加米酒復(fù)雜性。

表3 米酒理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indices of rice wine

2.2.2 米酒有機(jī)酸含量分析

米酒中有機(jī)酸種類豐富，共檢出有機(jī)酸8種，其中含量最高兩種有機(jī)酸為檸檬酸和乳酸。有機(jī)酸有助于穩(wěn)定酒體香氣，提高酒品質(zhì)，但含量過高則表現(xiàn)酸感突出、酒質(zhì)粗糙。檸檬酸酸味較長(zhǎng)，口感圓潤(rùn)清爽，但過量則辣口[16]，對(duì)照菌株發(fā)酵所得米酒產(chǎn)生的檸檬酸為0.71 g·L-1，是所有菌株中產(chǎn)檸檬酸量最高菌株。乳酸口感柔和，增加酒體醇厚度[17]，菌株167發(fā)酵的米酒乳酸含量最高，達(dá)0.55 g·L-1，作為一種溫和有機(jī)酸，更高濃度乳酸可能使酒體更柔滑。琥珀酸又稱丁二酸，具有酸味和咸苦味可調(diào)和酒體，其可形成丁二酸二乙酯等化合物，對(duì)酒的風(fēng)味具有重要影響[18]，菌株21、26、127和30發(fā)酵的米酒均具有含量較高的琥珀酸。蘋果酸酸感清爽，呈味持久且略帶刺激性，菌株之間蘋果酸含量差異小，占總有機(jī)酸含量12%～15%（見表4）。

表4 米酒有機(jī)酸組成Table 4 Organic acid components of rice wine (g·L-1)

2.2.3 米酒感官品評(píng)

按照黃酒品評(píng)描述對(duì)米酒作感官品評(píng)，表5顯示各菌株發(fā)酵所得米酒感官品評(píng)得分結(jié)果。所有菌株發(fā)酵米酒色澤差異較小，酒體澄清透明，但光澤較弱。香氣指標(biāo)下各菌株具有一定差異，其中菌株21、26發(fā)酵米酒香氣較為馥郁，酒香純正且有糯米香，菌株184和YSHJ發(fā)酵米酒酒香較為突出，但米香略弱，菌株89和127發(fā)酵米酒香氣愉悅度低，有輕微異雜味，整體酒香、米香不足。發(fā)酵米酒酒體普遍清爽柔和，其中，菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒的酒體更為協(xié)調(diào)，酸甜度較為適中。菌株127發(fā)酵米酒具有明顯辣口感和酸感，口感較差。典型性上雖得分差異小，但菌株21、26和YSHJ發(fā)酵米酒相較于其他菌株米酒發(fā)酵香氣更為突出。因此，將進(jìn)一步測(cè)定各菌株發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以分析其特點(diǎn)。

表5 米酒感官品評(píng)得分Table 5 Organoleptic evaluation of rice wine

2.2.4 米酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成分析

通過GC-MS檢測(cè)8種不同菌株發(fā)酵米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物，共檢測(cè)到揮發(fā)性化合物84種，其中包含25種醇類化合物，30種酯類化合物，8種酸類化合物12種醛酮類化合物和其他類化合物9種。菌株27發(fā)酵米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類最多，為60種。菌株67發(fā)酵米酒最少，為50種。菌株YSHJ、21和26發(fā)酵的米酒檢出55種，菌株30、89和104發(fā)酵米酒分別檢出56種、53種和54種揮發(fā)性風(fēng)味化合物（數(shù)據(jù)未顯示）。酯類化合物作為米酒中種類最多的揮發(fā)性化合物，主要以乙酯為主，如癸酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯等。醇類化合物含量最高分別為異戊醇、苯乙醇和異丁醇。

在所有化合物中，以醇酯類化合物含量最為豐富，可占到揮發(fā)性化合物總量87.08%～91.47%（見圖2）。作為對(duì)照菌株，YSHJ發(fā)酵米酒中，醇類化合物相對(duì)含量69.39%，酯類化合物占比19.64%，酸類化合物占比7.54%，醛酮酚類化合物占比3.28%。酯類化合物可促進(jìn)果香和花香等香氣產(chǎn)生[19]，對(duì)米酒香氣發(fā)揮積極作用，菌株26和30所得發(fā)酵酒中酯含量較高，占總揮發(fā)性風(fēng)味化合物24.22%和24.96%，其酸類化合物含量也相對(duì)較高，分別為9.75%和11.30%，適量的酸可提高酒的復(fù)雜程度和協(xié)調(diào)性。菌株89、167和184所得米酒醇類化合物占比在70%以上，菌株184發(fā)酵所得米酒中醇類化合物占比為所有菌株最高，為76.52%，高濃度醇類會(huì)產(chǎn)生刺激性氣味和苦澀味道[20]。

圖2 米酒揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成Fig.2 Composition of volatile compound in rice wine

揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)香氣的貢獻(xiàn)更多取決于其風(fēng)味閾值和在酒中實(shí)際含量。因此，選取酯類含量較為豐富的菌株21、26、30、127和YSHJ，對(duì)其米酒中22種揮發(fā)性風(fēng)味化合物作定量分析。

米酒中醇類物質(zhì)除乙醇外，主要為高級(jí)醇。高級(jí)醇是在發(fā)酵過程中，通過氨基酸脫羧和脫氨基形成。高級(jí)醇在酒中可使酒體更豐滿濃郁，但高級(jí)醇含量過高不僅破壞酒體協(xié)調(diào)，更易對(duì)人體造成損傷[21]，一般情況下發(fā)酵啤酒中高級(jí)醇含量＜100 mg·L-1，黃酒中高級(jí)醇含量為8～540 mg·L-1，葡萄酒中高級(jí)醇認(rèn)為＜300 mg·L-1[22]。異戊醇、異丁醇、苯乙醇和正丙醇是米酒中最主要高級(jí)醇。異戊醇、異丁醇具有明顯刺激性氣味和苦澀感，菌株127發(fā)酵米酒具有最高異戊醇產(chǎn)量（61.33 mg·L-1），菌株YSHJ發(fā)酵米酒具有最高異丁醇含量（67.99 mg·L-1）。苯乙醇可產(chǎn)生類似玫瑰、香甜和丁香的香氣，是米酒中獨(dú)特風(fēng)味化合物[23]，菌株YSHJ、127和26發(fā)酵米酒中苯乙醇產(chǎn)量較高，分別為10.24、9.04、7.68 mg·L-1，作為米酒釀造菌株可為米酒提供典型米酒香氣。

酯類化合物是黃酒香氣成分中含量第二高的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯和丁酸乙酯是米酒中含量較高的酯類化合物。其中，乙酸乙酯在各菌株中含量最高，為5.88～6.90 mg·L-1，作為米酒中主要酯類風(fēng)味化合物之一，乙酸乙酯酒有積極的香氣貢獻(xiàn)。乳酸乙酯在菌株21和30發(fā)酵所得米酒中未檢出，在其他菌株發(fā)酵米酒中含量為2.63～2.67 mg·L-1。乙酸異戊酯具有香蕉風(fēng)味。中鏈脂肪酸乙酯，如丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯可提供令人愉悅的果香。

表6 米酒中揮發(fā)性風(fēng)味化合物定量分析Table 6 Quantitative analysis of volatile compounds in rice wine

2.2.5 米酒主要揮發(fā)性化合物OAV

香氣活力值（Odor activity value，OAV）用于表征化合物對(duì)樣品香氣的貢獻(xiàn)程度，通過該揮發(fā)性風(fēng)味化合物在樣品中濃度與該化合物氣味閾值比值計(jì)算[24]，OAV大于1則表示該化合物對(duì)酒整體香氣具有明顯貢獻(xiàn)[25]。

由表7可知，根據(jù)OAV計(jì)算結(jié)果，22種揮發(fā)性化合物中共有13種化合物OAV＞1，是關(guān)鍵香氣化合物。苯乙醇作為米酒中具有特征風(fēng)味的化合物，其在4個(gè)菌株發(fā)酵米酒中香氣活力均不及對(duì)照菌株YSHJ，但菌株127和菌株26所得米酒相對(duì)較高，分別為1.81和1.54。乙酸異戊酯、丁酸乙酯和癸酸異戊酯OAV＞10，乙酸異戊酯具有香蕉、水果特征香氣，丁酸乙酯具有白蘭地、水果特征香氣，癸酸異戊酯具有香蕉、青草和白蘭地特征香氣。這些化合物可給酒體貢獻(xiàn)積極的果香味，但癸酸異戊酯在菌株127所得米酒中并未檢出。結(jié)合感官品評(píng)結(jié)果，YSHJ和菌株127發(fā)酵米酒香氣得分較低，酒精感較明顯，與其異丁醇和異戊醇濃度較高有關(guān)。

表7 主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物OAV及香氣描述Table 7 Odor activity value and aroma description of volatile compounds

芳樟醇和十六酸乙酯在除菌株21以外菌株所發(fā)酵米酒中均有檢出，芳樟醇雖含量較低，但菌株26、30和127發(fā)酵米酒對(duì)應(yīng)OAV＞1，可為酒提供花香和薰衣草香氣。十六酸乙酯具有果香、奶油香特征香氣，OAV＞4，菌株26發(fā)酵米酒十六酸乙酯OAV最高，為4.32。中、長(zhǎng)鏈脂肪酸乙酯被認(rèn)為是米酒中具有代表性的重要風(fēng)味化合物[27]。

酸類物質(zhì)是釀造酒中重要呈味物質(zhì)，可賦予酒體協(xié)調(diào)的口感。但高濃度下，產(chǎn)生脂肪、腐臭等異味，給酒帶來負(fù)面影響[28-29]，例如高含量辛酸造成酒風(fēng)味品質(zhì)下降。菌株127發(fā)酵米酒的酸類化合物OAV普遍高于其他菌株。菌株26發(fā)酵的米酒中酸類化合物OAV較低，感官評(píng)價(jià)香氣較為馥郁和諧。

對(duì)OAV值大于1的13種揮發(fā)性化合物作主成分分析。如圖3所示，前兩個(gè)PC描述67.55%方差，其中第一主成分PC1占方差46.22%，與癸酸異戊酯呈負(fù)相關(guān)。第二主成分PC2占方差21.33%，與十六酸乙酯、芳樟醇等呈正相關(guān)，與乙酸乙酯、正癸酸呈負(fù)相關(guān)?；衔镏g主成分得分有重疊，表明其含量具有相似特征。

圖3 米酒主成分分析Fig.3 Principal components analysis of rice wine

基于PC1和PC2計(jì)算得到每個(gè)菌株酒樣樣本分?jǐn)?shù)，F(xiàn)AC1和FAC2，分別對(duì)應(yīng)圖B中x和y軸，該圖顯示5株樣品在坐標(biāo)系中差異，樣品相距越遠(yuǎn)其差異值越大。

綜合上述研究，菌株NO.26發(fā)酵速度快，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成較優(yōu)，感官評(píng)價(jià)酒體協(xié)調(diào)，香氣馥郁，且?guī)в忻拙泼紫闩c清香，具有純種發(fā)酵優(yōu)質(zhì)米酒的潛力。

2.3 菌株鑒定

初步篩選獲得優(yōu)選菌株NO.26，提取菌體DNA后，采用BLAST方式將測(cè)定的18S rDNA序列與GenBank中序列作比對(duì)，生成系統(tǒng)發(fā)育樹。所有篩選菌株與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CBS 1 171模式菌株形成一個(gè)簇，表明篩選菌株為釀酒酵母，結(jié)果如圖4所示。

圖4 基于18S r DNA測(cè)序所構(gòu)建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeast based on 18S r DNA sequencing

3 討論與結(jié)論

優(yōu)質(zhì)酵母菌株對(duì)于釀造酒發(fā)酵至關(guān)重要，對(duì)口感和風(fēng)味均影響極大[30]。目前，對(duì)于米酒或黃酒酵母篩選多基于傳統(tǒng)釀造工藝，選育具有低產(chǎn)尿素[31]、低產(chǎn)高級(jí)醇[32]、高產(chǎn)β-苯乙醇[33]等菌株，對(duì)于篩選適用于純種液態(tài)米酒發(fā)酵的酵母菌株研究較少。純種釀酒酵母分離和應(yīng)用，有利于米酒釀造向現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)一步邁進(jìn)[3]。王瑩鈺使用6種黃酒酵母發(fā)酵液化法糜子黃酒，不同菌株之間發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成等存在顯著差異[34]。鄒凌波建立一種酶制劑完全替代酒曲液態(tài)米酒釀造工藝，并從酒曲和酒醪中篩選得到1株發(fā)酵能力較優(yōu)釀酒酵母，但并未根據(jù)其風(fēng)味特性和感官品評(píng)進(jìn)一步分析篩選[12]。

本試驗(yàn)以米酒酒曲和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株為篩選源，基于菌株產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)酒精試驗(yàn)，發(fā)酵性能試驗(yàn)和揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析，篩選獲得優(yōu)良釀酒酵母菌株NO.26。該菌株在糖度16%糯米糖液中，25℃發(fā)酵10 d可產(chǎn)生酒精度為7.19%V/V米酒，發(fā)酵速率快，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)。使用該菌株發(fā)酵所得米酒中多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物如苯乙醇、芳樟醇、十六酸乙酯等均優(yōu)于其他菌株或處于較高水平，釀造米酒具有發(fā)酵米酒典型米香和清香，口感清爽鮮甜，感官品評(píng)結(jié)果優(yōu)于其他菌株。

目前，適用于米酒發(fā)酵的菌株多樣性不足，嚴(yán)重限制米酒風(fēng)格豐富性。研究對(duì)酵母菌株發(fā)酵特性提供系統(tǒng)的選育方法，并篩選得到具有優(yōu)良釀造品質(zhì)的釀酒酵母，對(duì)于未來開發(fā)純種液態(tài)法米酒產(chǎn)品具有較強(qiáng)工業(yè)應(yīng)用參考。