白芍花提取工藝及功能性飲料的研究

徐睿，李美景，劉榮，冉紅燕，龍玉婷，熊麗娟，謝凱莉，龔慕辛*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069；2.中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069）

白芍花是毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥花蕾，為中藥白芍的非藥用部位，是種植中藥的副產(chǎn)物，具有很高的觀賞價值[1]和藥食兩用價值[2]。但在藥用芍藥栽培過程中，其花常常被當(dāng)作廢棄物，造成資源浪費[3]。白芍花常用來治療因內(nèi)分泌紊亂引起的雀斑、黃褐斑、暗瘡，可延緩皮膚衰老，促進(jìn)新陳代謝，提高機(jī)體免疫力[4]。研究顯示上述作用與其所含有的花色苷、黃酮、單萜苷和酚酸類成分有關(guān)[5-8]。前期研究測定了不同栽培品種及干燥工藝白芍花的體外抗氧化、抑制酪氨酸酶、胰脂肪酶活性以及其中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸等9種活性成分含量[9]，發(fā)現(xiàn)栽培品種“亳州芍藥”烘干品的綜合活性以及活性成分含量最高，同時建立了各活性與9種成分的相關(guān)關(guān)系，確定了對上述活性有益的正向成分和不利的負(fù)向成分及對各活性的影響系數(shù)。目前以同屬毛茛科、芍藥屬的牡丹花為原料的食品研究類型很多[10]，但對于白芍花尤其是飲料類型的產(chǎn)品研發(fā)較少，本研究擬在此基礎(chǔ)上開發(fā)一種白芍花提取物飲料，拓展白芍花的用途。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芍花：采集于白芍主產(chǎn)區(qū)安徽亳州，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院李佳副教授鑒定為毛茛科植物芍藥的干燥花蕾，在60℃下熱風(fēng)烘干。

對照品芍藥苷[（paeoniflorin，PF）批號L26A0003，純度≥95%]、沒食子酸[（gallic acid，GA）批號BD09A036，純度≥98%]、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-7-O-β-D-glucoside，Qu7G） 批號 BC08A031，純度≥98%]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（quercetin-3-O-β-D-glucoside，Qu3G）批號 BA25B061，純度≥98%]、紫云英苷[（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside，Km3G）批號BF27A070，純度≥98%]、芍藥內(nèi)酯苷[（albiflorin，AF）批號 CI17B213，純度≥95%]、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷[（isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside，Is3G）批號BF27A033，純度≥95%]：成都普思生物科技股份有限公司；山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷[（kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside，Km7G）批號 D01S9S69103，純度≥98%]：上海源葉生物科技有限公司；芍藥素-3，5-O-β-二葡萄糖苷[（peonidin-3，5-O-β-diglucopyranoside，Pn3G5G）批號 0509/0-02，純度≥95%]：法國EXTRASYNTHESE公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Fisher公司；甲酸、95%乙醇（均為分析純）：北京化工廠；液相用水為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）（1260 infinity Ⅱ型）：美國安捷倫公司；微波萃取裝置（P70D20TL-D4型）：佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；1/10萬電子天平（DV215CD型）：美國奧豪斯公司；1/100電子天平（TP-402型）：丹佛儀器（北京）有限公司；超聲波清洗器（KQ-500E型）：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（J1811252型）：北京西沖科技發(fā)展有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HHS-11-6型）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

稱取亳州芍藥干燥花蕾20 g，粉碎（過100目篩），按照單因素試驗和正交試驗的不同方案進(jìn)行提取，兩層濾紙抽濾，在60℃水浴下減壓濃縮至無醇味，以70%乙醇定容至100 mL，超聲混勻10 min，精密量取5 mL溶液至蒸發(fā)皿中，在85℃水浴上揮干，加適量甲醇溶解殘渣并定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，得質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的白芍花甲醇溶液。

1.3.2 9種活性成分含量的測定

參考前期試驗方法，并進(jìn)行一定調(diào)整[9]。精密稱取9種對照品，用甲醇溶解得到對照品母液。分別取適量對照品母液混合，加甲醇定容得到的初始濃度分別為 0.525 0、0.198 0、0.500 0、0.645 0、0.179 0、0.100 0、0.288 0、0.125 0、0.110 0 mg/mL 的 GA、Pn3G5G、AF、PF、Qu7G、Qu3G、Km3G、Is3G、Km7G 混合對照品溶液，依次稀釋得到不同濃度的其它混合對照品溶液。將上述混合對照品溶液依次進(jìn)樣，在275、525、230、350 nm 4種波長下測定其峰面積，以各成分色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品中各成分的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將供試品溶液按相同方法操作，通過已鑒定出的9種成分所對應(yīng)的峰面積，計算樣品中相應(yīng)的含量。

1.3.3 提取物活性綜合評分的計算

根據(jù)前期對白芍花9種有效成分的化學(xué)成分及其活性進(jìn)行相關(guān)分析，得到各成分體外抗氧化活性、抑制酪氨酸酶活性、抑制胰脂肪酶活性標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)K，其中對活性有正向作用的成分K值為正，負(fù)向作用的成分K值為負(fù)。隨后對各活性成分含量進(jìn)行歸一化處理，以各成分含量的歸一化值di與標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)Kij（i為各成分，j為各活性指標(biāo)）乘積之和作為多成分轉(zhuǎn)換成的某一活性值，即活性j（j分別為抑制酪氨酸酶、抑制胰脂肪酶、抗氧化活性），其中抗氧化的活性j取抗氧化1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法、鐵離子還原法以及二銨鹽法三者活性j的均值，而每個樣品3個活性j之和即為該樣品的活性綜合評分，計算公式為：活性j=∑Kidi。

1.3.4 工藝流程

亳州芍藥干燥花蕾→適度破碎→70%乙醇浸泡→微波輔助提取→過濾→濃縮→添加輔料→裝瓶→冷卻→滅菌→檢驗→成品

1.3.5 工藝要點

1.3.5.1 提取方式的選擇

根據(jù)1.3.2方法測定3種提取方法測得9種活性成分含量，并按照1.3.3方法計算不同提取方式所得白芍花提取液的綜合評分。1）加熱回流法：準(zhǔn)確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h。2）溫浸法：準(zhǔn)確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇在60℃水浴下浸提2次，每次1 h。3）微波輔助提取法：準(zhǔn)確稱量粉碎后亳州芍藥干燥花蕾20 g，用15倍量70%乙醇常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min（分4次，每次1 min，冷卻至45℃再提取），提取2次。提取物用兩層濾紙抽濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少量溶液后，用70%乙醇定容至100 mL，即得樣品溶液。

1.3.5.2 單因素試驗

根據(jù)提取工藝試驗結(jié)果，固定提取方式為采用微波輔助提取，以綜合評分為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗。固定料液比為 1∶15（g/mL），先常溫浸泡 30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min，提取2次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，先常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取時間為4 min，提取2次，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30 min，提取時間為4 min，提取2次，考察功率（160、320、480、560 W）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30min，微波功率為480W，提取時間為4min，考察提取次數(shù)（1、2、3、4次）對樣品綜合評分的影響。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶15（g/mL），先常溫浸泡30 min，微波功率為480 W，提取2次，考察提取時間（1、2、3、4 min）對樣品綜合評分的影響。

1.3.5.3 提取工藝正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取次數(shù)為3次，確定以提取時間（A）、微波功率（B）、料液比（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為試驗因素進(jìn)行正交試驗，因素水平見表1。

表1 提取工藝正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction process

1.3.6 白芍花提取物飲料配方優(yōu)化正交試驗

根據(jù)前期單因素試驗考察結(jié)果，初步確定加水稀釋倍數(shù)為 5倍，以阿斯巴甜（a）、檸檬酸（b）、乙基麥芽酚（c）添加量為試驗因素進(jìn)行正交試驗，每個因素3個水平，因素水平設(shè)計見表2。

表2 配方優(yōu)化正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for formula optimization

邀請10名同學(xué)和老師為感官評價小組，以感官評分為指標(biāo)，對不同輔料添加量的9組白芍花飲料進(jìn)行感官評價。其中，產(chǎn)品感官評價標(biāo)準(zhǔn)分別從甜味、香味、澀味、酸味、外觀5個方面進(jìn)行評分。提取物飲料調(diào)配感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 提取物飲料的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards for extract beverage

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖形的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

提取方式對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖1。

圖1 提取方式對綜合評分的影響Fig.1 The effect of extraction method on the comprehensive score

由圖1可知，以加熱回流法提取方式綜合評分最高，溫浸法得分最低。但加熱回流法提取時間長，雜質(zhì)溶出率高，靜置后沉淀多。而微波輔助提取利用被加熱物質(zhì)的極性分子在電磁場中快速轉(zhuǎn)向及定向排列產(chǎn)生熱量，以達(dá)到提取效果[11]，其選擇性高、加熱迅速、滅菌能力強(qiáng)、安全無污染[12-13]，參照文獻(xiàn)[14-16]進(jìn)行比較，并結(jié)合生產(chǎn)中的實際要求，最終確定采用微波輔助提取方式對白芍花進(jìn)行提取。

十九大報告中明確提出“培養(yǎng)造就一支懂農(nóng)業(yè)、愛農(nóng)村、愛農(nóng)民的‘三農(nóng)’工作隊伍”［1］?；鶎愚r(nóng)技人員隊伍是“三農(nóng)”工作隊伍的重要組成部分，他們長期扎根基層、切實服務(wù)“三農(nóng)”，是培育造就有文化、懂技術(shù)、會經(jīng)營的新型職業(yè)農(nóng)民，發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要力量。臺州科技職業(yè)學(xué)院作為浙江省九大現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)培訓(xùn)基地之一，承擔(dān)浙江省基層農(nóng)技人員知識更新培訓(xùn)任務(wù)。基于往年培訓(xùn)中發(fā)現(xiàn)有基層農(nóng)技人員在培訓(xùn)課間流露對自身職業(yè)存在倦怠感的情況，而開始關(guān)注我省基層農(nóng)技人員的職業(yè)狀態(tài)，并著手開展調(diào)研，探究其真實職業(yè)現(xiàn)狀、挖掘倦怠原因、有針對性地提出相關(guān)建議。

2.2 提取工藝單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

乙醇體積分?jǐn)?shù)對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the comprehensive score

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綜合評分逐漸升高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時綜合評分達(dá)到最高值?？梢娫?0%～70%范圍內(nèi)，體積分?jǐn)?shù)與綜合評分呈正相關(guān)。根據(jù)相似相溶原理，較高的乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于脂溶性的酚酸類、單萜類、黃酮類物質(zhì)溶解，從而增加了綜合評分。同時考慮到過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)在進(jìn)行微波輔助提取時會帶來安全隱患，所以未進(jìn)行更高體積分?jǐn)?shù)的試驗，因此選擇50%～70%進(jìn)行正交試驗。

2.2.2 料液比的確定

料液比對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖3。

圖3 料液比對綜合評分的影響Fig.3 The effect of solid-to-liquid ratio on the comprehensive score

由圖 3 可知，料液比為 1∶15（g/mL）時綜合評分高于其它3組。原因可能是隨著溶劑體積增加，傳質(zhì)推動力增大，活性成分的提取量會不斷增多[17]；料液比從1∶15（g/mL）增加至 1∶25（g/mL）時，綜合評分略有下降。因此正交試驗選擇 1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.3 微波功率的確定

微波功率對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖4。

圖4 微波功率對綜合評分的影響Fig.4 The effect of microwave power on the comprehensive score

由圖4可知，綜合評分隨著微波功率的增大先升高后降低，功率為480 W時評分最高，但320、560 W與480 W評分差距不明顯。其原因是隨著微波功率增大產(chǎn)生的熱效應(yīng)更強(qiáng)，但更高的功率也會增加影響綜合評分的負(fù)向成分的提取率，也會破壞部分活性成分的結(jié)構(gòu)[18]。因此正交試驗選擇320 W～560 W進(jìn)行優(yōu)化。

提取次數(shù)對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖5。

由圖5可知，綜合評分隨著提取次數(shù)的增加而升高，且提取次數(shù)達(dá)到3次后，再增加提取次數(shù)對綜合評分影響較小，從生產(chǎn)工藝角度來說，更多的提取次數(shù)會增加生產(chǎn)成本以及時間，因此確定提取次數(shù)為3次。

圖5 提取次數(shù)對綜合評分的影響Fig.5 The effect of extraction times on the comprehensive score

2.2.5 提取時間的確定

提取時間對亳州芍藥干燥花蕾提取物綜合評分的影響見圖6。

圖6 提取時間對綜合評分的影響Fig.6 The effect of extraction time on the comprehensive score

由圖6可知，綜合評分隨著提取時間的增加先升高，在3 min時達(dá)到最大值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是微波輔助提取時間過長產(chǎn)生的高溫會使以槲皮素為苷元的黃酮苷發(fā)生降解[19]，同時PF含有的苯甲酸酯鍵在有水的條件下受熱易分解或受其他成分的干擾[20]。因此正交試驗選擇2 min～4 min進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 提取工藝正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以綜合評分為考核指標(biāo)，按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗，每組試驗重復(fù)兩次，取其平均值，對亳州芍藥干燥花的提取工藝條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，其試驗結(jié)果見表4、表5。

表4 提取工藝優(yōu)化正交試驗Table 4 Orthogonal test design for optimization of extraction process

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，亳州芍藥干燥花蕾提取中影響綜合評分主次順序為提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞料液比；由正交試驗得出最優(yōu)因素水平組合為A1B2C2D2，即提取時間 2min、微波功率 480W、料液比 1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取3次。由方差分析結(jié)果可知，提取時間、微波功率、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)均對亳州芍藥干燥花蕾綜合評分影響顯著。

2.4 驗證試驗

按最優(yōu)組合條件A1B2C2D2即正交試驗2號組，提取3次，測定其9種活性成分含量，并計算其綜合評分，結(jié)果分別為3.000 0、2.838 9、2.888 0，平均值為2.909 0，接近正交試驗最好值2.990，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.84%，說明優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

2.5 配方優(yōu)化試驗

以感官評分為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗，依據(jù)表2的感官評價標(biāo)準(zhǔn)對白芍花提取物飲料進(jìn)行評分，其試驗結(jié)果見表6。

表6 配方優(yōu)化正交試驗Table 6 Orthogonal test design for formula optimization

由表6可知，白芍花提取物飲料配方優(yōu)化中影響感官評分主次順序為阿斯巴甜＞檸檬酸＞乙基麥芽酚；由正交試驗得出最優(yōu)因素水平組合為a3b2c3，即阿斯巴甜含量0.032%、檸檬酸含量0.4%、乙基麥芽酚含量0.06%與正交優(yōu)化結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和正交試驗，得出白芍提取物飲料的工藝參數(shù)和最適輔料添加量。采用微波輔助提取技術(shù)，最佳提取條件為微波功率480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù) 60%、料液比 1∶20（g/mL），提取時間 2 min，提取3次；將提取物溶液稀釋5倍，加入0.032%阿斯巴甜、0.4%檸檬酸、0.06%乙基麥芽酚，所制成的白芍花提取物飲料感官評分為78.0分，風(fēng)味獨特，達(dá)到了預(yù)期的效果。