熱帶紅睡蓮精油主要成分及其抑菌活性分析

陳彥甫，范楊楊，周衛(wèi)娟，李子馨，李兆基，王健，趙瑩*，羅海希

（1.海南大學林學院，熱帶特色林木花卉遺傳與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，海南省熱帶特色花木資源生物學重點實驗室，海南 ?？?570228；2.海南科技職業(yè)大學海南省藥食同源植物資源重點實驗室，海南 ?？?571126）

熱帶睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）植物中廣泛分布于熱帶地區(qū)的類群的統(tǒng)稱，是多年生草本水生花卉。由于其花色艷麗、豐富，具有很高的觀賞價值，同時睡蓮的根具有凈化水體的作用，熱帶睡蓮逐漸成為園林設計中重要的水生植物[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)睡蓮屬植物富含黃酮、酚酸等多種活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗輻射、降血糖等多種生物活性[2-3]。熱帶睡蓮的花和葉制成的食品及護膚品深受大眾喜愛[3-4]。Zhang等[5]通過系統(tǒng)基因組學分析證實了熱帶睡蓮是所有現(xiàn)存被子植物中的基部類群，是被子植物中最古老的分支之一。

熱帶紅睡蓮（Nymphaea rubra）因其花期長、品質優(yōu)良、繁殖能力強，成為熱帶水景園林設計中異軍突起的新優(yōu)種類。根據(jù)范楊楊等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，其相比于埃及白睡蓮（Nympheae lotus）、藍鳥睡蓮（Nymphaea'Blue Bird'）等常見熱帶睡蓮品種，熱帶紅睡蓮的含水量、可溶性蛋白含量、維生素C含量更為突出，營養(yǎng)價值高，由此可見熱帶紅睡蓮在食藥工業(yè)具有廣闊的開發(fā)與應用前景。

近年來關于睡蓮的研究主要集中于熱帶睡蓮品種的栽培與選育[7]、基因組及形態(tài)多樣性分析[8-9]、睡蓮的生理機制[10-11]、睡蓮在吸收重金屬離子及凈化污水[12]等方向，但睡蓮精油的提取工藝研究較少。植物精油在食品、化妝品等行業(yè)應用前景廣闊，目前研究植物精油的主要提取手段有微波輔助提取、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取、亞臨界水萃取等方法，吳曉菊等[13]采用4種提取方法分別提取神香草精油，比較4種方法的精油得率后得知超臨界CO2流體萃取法的精油得率要高于水蒸氣蒸餾法。同時超臨界流體萃取法相比于工藝較簡單的水蒸氣蒸餾法和微波輔助提取法來說，采用的流體（如CO2）通常無害，有機溶劑殘留的風險較少，是目前眾多提取方法中較為環(huán)保并且精油得率較高的一種提取手段[14-15]，近幾年關于應用超臨界流體技術萃取植物油脂方面的研究也日趨增多。

同時，植物精油抗氧化能力較強[16]，近年來研究表明植物提取精油在一定程度上對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌具有顯著的抑制作用，且抑制作用受溫度影響變化較小[17-20]，具備一定的紫外穩(wěn)定性[21]。植物精油還可降低化妝品的刺激性，在化妝品行業(yè)中起著極為關鍵的作用[22]。目前對熱帶睡蓮精油的抑菌能力及抗氧化活性的研究較少，對其進行抑菌活性測定，將為熱帶睡蓮精油在化妝品行業(yè)中的應用提供參考。

本研究采用超臨界CO2流體萃取法提取熱帶紅睡蓮精油，對精油組分進行氣相色譜-質譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）分析，鑒定出熱帶紅睡蓮精油內各化合物組分，并對熱帶紅睡蓮精油進行抑菌活性測定，探究精油對6種常見菌種的抑制能力，以期為熱帶紅睡蓮精油的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱帶紅睡蓮：印度紅睡蓮（Nymphaea rubra），海南榮豐花卉有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（CP）、葡萄糖（AR）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）（AR）：西隴科學股份有限公司；YPD培養(yǎng)基（EA）：上海吉至生化有限公司；腺嘌呤（EA）：生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素、結晶牛血清蛋白（低內毒素）：上海麥克林生化科技有限公司；2，6-二叔丁基對甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）（EA）：上海偉寰生物科技有限公司；氯化鈉（AR）：國藥集團化學試劑有限公司；吐溫80：海南金唯諾生物科技有限公司；大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉（均需4℃低溫保藏）：海南子約儀器設備有限公司。

1.2 儀器與設備

XMTD-8222電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；SPE-EDAFE-2超臨界CO2流體萃取儀：美國Applide Separations公司；UV-5500紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 超臨界CO2方法萃取熱帶紅睡蓮精油

首先將紅睡蓮鮮花花瓣在電熱恒溫干燥箱中45℃下干燥7 h，待其達到恒重時，在粉碎機中進行粉碎，將得到的干粉備用。

參考黃秋偉等[7]的試驗方法萃取精油。稱取40 g紅睡蓮干粉，裝入1 L的裝料罐，將其放入萃取釜中密封。將CO2流速控制在30 L/h，分離釜Ⅰ壓力設定為6.0 MPa、分離釜Ⅰ溫度設定為30℃；分離釜Ⅱ壓力設定為5.8 MPa、分離釜Ⅱ溫度設定為25℃，設定好分離條件后，設置萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為35℃，萃取時間2 h，進行動態(tài)循環(huán)萃取，當萃取結束后，從分離釜中接取得到的物料，使用注射器吸取漂浮于上層的黃色油層進行稱重，在－20℃條件下進行冷凍備用，按照下式計算精油得率。

式中：m1為分離釜Ⅰ出口精油質量，g；m2為分離釜Ⅱ出口精油質量，g；m為紅睡蓮干粉質量，g。

1.4 熱帶紅睡蓮精油成分GC-MS分析

1.4.1 固相微萃取

萃取前，取紅睡蓮精油0.6 g，放入5 mL進樣瓶中，使用硅膠墊密封進樣瓶。隨后，取100 μm聚二甲基硅氧烷固相微萃取手動進樣萃取頭，250℃預熱2 h，由頂部插入樣品瓶，28℃萃取80 min。將萃取頭向GC-MS汽化室內快速插入，于230℃溫度下進行3 min洗脫處理。以離子源（electron ionization，EI）為電離源進行氣相色譜-質譜分析。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：使用色譜柱為石英毛細管柱，將流速設定為0.3 L/min、進樣量 1 μL、分流比 10∶1；進樣溫度250℃，四極桿溫度150℃。升溫程序：在5℃/min速度下升至170℃，在2.5℃/min速度下再升至250℃，到指定溫度后維持15 min。

MS條件：選擇EI離子源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度280℃，溶劑延遲5 min，電子能70eV，掃描質量范圍29amu～450amu。以Nist 2005質譜鑒定分析總離子流圖內各峰的質譜圖結果。以峰面積歸一化法來計算各成分的相對含量。

1.5 熱帶紅睡蓮精油抑菌活性測定

1.5.1 濾紙片法測定抑菌圈直徑

取1.3中得到的紅睡蓮精油1 g，溶解于5 mL DMSO中，得到紅睡蓮精油溶液。把濾紙片貼于含菌平板上，3片/皿，向各濾紙上滴加精油溶液0.01 mL，同時分別滴加等量吐溫80、青霉素，以作參照，將細菌移至培養(yǎng)箱內，37℃培養(yǎng)1 d，將真菌移至培養(yǎng)箱內，28℃培養(yǎng)3 d。每組試驗重復5次，每皿使用交叉法測量抑菌圈直徑3次，取平均值，分析熱帶紅睡蓮精油對各供試菌種的抑菌活性。

1.5.2 紅睡蓮精油熱穩(wěn)定性檢測

將精油分別在 30、40、50、60 ℃水浴 15 min。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為例，使用上述濾紙片法測定抑菌圈直徑，交叉法測量3次，每組試驗重復5次，結果取平均值。比較分析熱處理對熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

1.5.3 紅睡蓮精油紫外穩(wěn)定性檢測

使用紫外燈照射紅睡蓮精油溶液，照射時間分別為 10、20、30、40、50、60 min。以 1.5.1 方法測量抑菌圈直徑，結果取平均值。比較分析紫外處理對熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

1.5.4 紅睡蓮精油酸堿穩(wěn)定性檢測

使用 NaOH 溶液（1 mol/L）及 HCl溶液（1 mol/L）對固體培養(yǎng)基的pH值進行調節(jié)，獲得pH值為4、5、6、7、8、9的培養(yǎng)基。以1.5.1方法測量抑菌圈直徑，結果取平均值。比較分析不同pH值對熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

2 結果與分析

2.1 熱帶紅睡蓮精油GC-MS分析

借助GC-MS聯(lián)用儀對熱帶紅睡蓮精油成分展開分析，同時通過峰面積歸一法，明確各組分相對含量，圖1為總離子流圖，分析結果詳情如表1所示。

表1 熱帶紅睡蓮精油成分Table 1 Essential oils composition of tropical red water lily

圖1 超臨界CO2提取熱帶紅睡蓮精油總離子流圖Fig.1 Supercritical CO2extraction of tropical red water lily essential oil total ion flow diagram

由圖1和表1可知，運行至5 min時，開始出峰，然而裂解電壓較低，大多處于0.2×102eV～0.8×102eV區(qū)間；當進行至24 min～28 min時，裂解電壓上升至1.0×102eV。超臨界CO2流體萃取出的紅睡蓮精油含有41種化合物，其中烷烴、烯醛、烷酮、醇類為主要成分。這些成分中含芳香環(huán)的有苯甲醇、對苯二甲醚、1，4-二甲氧基甲苯、3，4-二甲氧基苯酚、4-甲氧基-3-（甲氧基甲基）苯酚與甲氧甲酚，但是缺少呈濃香的單萜和倍半萜，表明熱帶紅睡蓮精油的芳香度要低于玫瑰精油、薰衣草精油等濃香型植物精油。

2.2 熱帶紅睡蓮精油抑菌性分析

2.2.1 抑菌圈測定結果

不同供試菌種的抑菌圈直徑見表2。

表2 熱帶紅睡蓮精油對不同供試菌種的抑菌圈直徑Table 2 Diaphragm diameter of tropical red water lily oil for different tested strains

由表2可知，大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.73 mm，銅綠假單胞菌抑菌圈直徑為8.33 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為8.86 mm，枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑為9.39 mm，釀酒酵母抑菌圈直徑為8.40 mm，黑曲霉抑菌圈直徑為7.97 mm。熱帶紅睡蓮精油對供試菌的抑菌活性由強到弱依次為枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母、銅綠假單胞菌、黑曲霉。

2.2.2 熱帶紅睡蓮精油熱穩(wěn)定性結果

溫度與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系見表3。

表3 溫度與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系Table 3 Relationship between temperature and antibacterial activity of tropical red water lily oil

通過表3結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱處理后，熱帶紅睡蓮精油抑制大腸桿菌的活性相比金黃色葡萄球菌略強；該精油在溫度低于50℃時，對兩種菌的抑菌活性隨著溫度上升而增強，且50℃處理對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有最佳抑菌活性?？傮w來看，當處理溫度達到50℃以后，精油的抑菌效果均減弱，但依然維持了一定的抑菌效果。

2.2.3 熱帶紅睡蓮精油紫外穩(wěn)定性結果

紫外處理時間與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系見表4。

表4 紫外處理時間與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系Table 4 Relationship between UV treatment time and antibacterial activity of tropical red water lily oil

由表4可知，熱帶紅睡蓮精油經(jīng)過不同時間的紫外照射后，抑菌活性上下波動，且在紫外處理20 min時具有最佳抑菌活性。但各紫外處理時間下，抑菌效果差異不顯著（p＞0.05），說明熱帶紅睡蓮精油具有一定的紫外穩(wěn)定性。

2.2.4 熱帶紅睡蓮精油酸堿穩(wěn)定性

培養(yǎng)基pH值與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系見表5。

表5 培養(yǎng)基pH值與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關系Table 5 Relationship between pH of culture medium and antibacterial activity of tropical red water lily oil

由表5可知，在熱帶紅睡蓮精油供試菌種中，pH 4、6、9時對大腸桿菌抑制效果較好，pH7、8時對金黃色葡萄球菌抑制效果較好。但各pH值下抑菌效果差異不顯著（p＞0.05），說明熱帶紅睡蓮精油具有廣譜酸堿穩(wěn)定性。

3 討論

研究表明，熱帶紅睡蓮精油對于6種供試菌皆表現(xiàn)出一定抑制效果，包括2類革蘭氏陰性菌（Gram negative bacteria，GNB）（枯草芽孢桿菌與大腸桿菌）、2類革蘭氏陽性菌（Gram positive bacteria，GPB）（銅綠假單胞菌與金葡菌）、2類真菌（黑曲霉與釀酒酵母）。其中對GPB的抑制效果相比GNB偏高，是由于GNB的細胞壁內存在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），可阻止疏水性成分向菌體內轉移[23]，具有保護菌體的作用，馬立[24]的研究顯示，酚類物質會導致LPS結構受損。同時，王勇[25]發(fā)現(xiàn)植物精油中的丁香酚、肉桂醛和檸檬烯等是有效抑菌成分，尤其丁香酚具備芳香環(huán)結構，含極性基團，此類基團可結合菌中部分酶的活性基團，使其正常的代謝機能受損，抑制菌體生長。由此可以推測，酚類物質、甲基丁香酚和各種烯醛類化合物是紅睡蓮精油具有抑菌活性的關鍵所在。可為后續(xù)提升睡蓮精油抑菌性提供理論依據(jù)。同時，熱帶紅睡蓮精油穩(wěn)定性試驗的結果表明，熱帶紅睡蓮精油具有良好的熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性，可廣泛應用于實際生產及生活中。

熱帶紅睡蓮精油對常見菌種的抑制效果雖比不上茶樹精油等具有極強抑菌效果的精油產品，但與玫瑰、鼠尾草、薰衣草等精油相比，不僅抑菌效果較好且具有良好的穩(wěn)定性。除此之外，因熱帶紅睡蓮精油對金黃色葡萄球菌有較強的抑制效果，而金黃色葡萄球菌是引起痤瘡等皮膚炎癥的主要原因之一，所以可考慮制備含熱帶紅睡蓮精油的護膚品。

4 結論

采用超臨界CO2流體萃取熱帶紅睡蓮精油，并用GC-MS檢測所提精油主要成分，結果顯示精油含有大量烷烴、烯烴、酮類、酯類物質，為精油的抑菌性和抗氧化性奠定基礎。熱帶紅睡蓮精油對試驗中供試菌的抑菌能力為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞釀酒酵母＞銅綠假單胞菌＞黑曲霉。表明對革蘭氏陽性菌抑制能力大于革蘭氏陰性菌，同時精油在抑菌能力方面具備一定熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，即在 30℃～60℃、紫外線處理 10 min～60 min、pH4～9時，熱帶紅睡蓮精油的抑菌圈大小沒有顯著差異。