植物精油對(duì)柑橘的保鮮效果

潘小軍,陳媛,江和棟

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江西 南昌,330004)

柑橘營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,種植面積大。根據(jù)國(guó)際糧農(nóng)組織(International Food and Agriculture Organization,FAO)顯示,中國(guó)柑橘類水果的種植面積約占全世界的1/3,年產(chǎn)量大于100萬(wàn)t[1]。柑橘內(nèi)含有豐富的糖分與水分,腐爛率通常在10%～30%[2],造成的經(jīng)濟(jì)損失非常大,研究柑橘保鮮技術(shù)對(duì)降低釆后損失具有重要意義。在中國(guó)的柑橘貯藏中,常用具有抑菌或殺菌作用的化學(xué)藥物、涂蠟、浸泡保鮮劑、包裹保鮮袋等方法來(lái)防止由機(jī)械損傷而帶來(lái)的霉菌感染,這些傳統(tǒng)的保鮮方法對(duì)于消費(fèi)者安全食用果蔬和高效攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言,依然存在較大差距[3]。因此尋找安全高效、低毒、低殘留的保鮮劑已成為一種趨勢(shì)。天然資源植物精油慢慢地成為柑橘貯藏中病害防治的有效方式[4]。

植物精油是從草本植物的花、樹(shù)皮、種子和果實(shí)中萃取得到的芳香物質(zhì),分子小,揮發(fā)性高,是一種難溶于水的油狀液體。據(jù)已有報(bào)道,多種植物內(nèi)含有酚類、類黃酮素和抗毒素等物質(zhì),這些物質(zhì)有一定的抗菌活性。趙恭文等[5]發(fā)現(xiàn)植物提取液對(duì)某些植物病原真菌有較強(qiáng)的抑菌作用,并分析這些藥用植物活性成分很可能在植物精油中。精油這類天然物質(zhì)具有安全環(huán)保、低毒低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn),常用于鮮切水果、果蔬保鮮以及作物腐敗菌和致病菌的控制,但某些精油本身的特性會(huì)對(duì)果蔬的感官評(píng)價(jià)產(chǎn)生影響。為解決此問(wèn)題,在食品保鮮時(shí)最好用涂層保鮮配方[6]。柑橘貯藏期間,果實(shí)pH通常在2.2～4.0,呈酸性,多數(shù)果實(shí)的腐爛由真菌引起[7],其中主要的病菌是意大利青霉和指狀青霉[8],在釆后保鮮和運(yùn)輸過(guò)程中,造成的損失約為柑橘類水果總損失的90%[9]。目前很多研究表明,植物精油對(duì)多種作物腐敗菌和致病菌有明顯抑制作用,但很多試驗(yàn)只針對(duì)單一或少數(shù)幾種植物精油進(jìn)行研究,且效果不一。

本試驗(yàn)研究預(yù)選的13種植物精油對(duì)柑橘主要致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指狀青霉(Penicilliumdigitatum)的抑制作用,并測(cè)得強(qiáng)抑制作用精油的最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC),對(duì)柑橘進(jìn)行打孔貯藏試驗(yàn),探究其實(shí)際的保鮮效果,為植物精油用于柑橘的貯藏保鮮提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

市售“紐荷爾”臍橙,選取大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害、成熟度一致的臍橙進(jìn)行試驗(yàn)；意大利青霉(PenicilliumitalicumGDMCC 3.489)、指狀青霉(PenicilliumdigitatumGDMCC 3.490),廣東省微生物菌種保藏中心；丁香、牛至、桂皮、八角、鼠尾草、百里香、迷迭香、檸檬桉,肉豆蔻、廣藿香、生姜、雪松以及甘草精油,美國(guó)諾奧(Now Foods)公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇,AR,天津市永大化學(xué)試劑有限公司；吐溫80,CP,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YP電子天平,上海律平科學(xué)儀器有限公司；DW-9微生物試劑分液器,杭州大微生物技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器、GR-240型熱空氣消毒箱、HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；JP-100B型超聲波清洗機(jī)、BCD-275TMBC型冰箱,青海海爾股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 十三種植物精油抑菌圈的測(cè)定

(1)菌懸液的制備：活化后的供試菌被接種到PDA平板培養(yǎng)基上,放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周；用無(wú)菌蒸餾水將培養(yǎng)菌邊過(guò)濾邊洗入試管中,采用2倍稀釋法將供試病原菌稀釋至孢子濃度為108CFU/mL。

(2)濾紙圓片的制備：用直徑為6 mm的打孔器于約3 mm厚的紙板打孔,獲取的濾紙圓片放于玻璃培養(yǎng)皿濕熱滅菌,放于干燥箱24 h,無(wú)菌條件保存,備用。

(3)制作含菌平板：菌懸液吸取1 mL于提前準(zhǔn)備好的PDA平皿培養(yǎng)基涂抹均勻,將在植物精油原液中充分浸泡(30 s)后瀝干的濾紙圓片放入上述已含意大利青霉、指狀青霉的平皿中,25 ℃培養(yǎng)72 h,觀察菌的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)重復(fù)3次,最后結(jié)果取其平均值。

(4)抑菌圈直徑的測(cè)量：用十字交叉法量取平皿抑菌圈直徑,平均直徑=(最大抑菌圈直徑-濾紙片直徑)/2

1.3.2 MIC和MBC的測(cè)定

根據(jù)抑菌圈試驗(yàn)選取上述幾種強(qiáng)效植物精油,2倍稀釋法將PDA培養(yǎng)基配制成最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.012 5%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的含植物精油的培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)置對(duì)照(不含植物精油)。用平板涂布的方法,用無(wú)菌接種環(huán)將菌液在已經(jīng)凝固且混合均勻的精油的PDA培養(yǎng)基中劃一條菌液線。重復(fù)試驗(yàn)3次,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,待對(duì)照組培養(yǎng)皿中菌絲體充分生長(zhǎng)后,與對(duì)照相比,觀察植物精油各濃度對(duì)菌的抑制效果,無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為MIC。將無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后觀察,以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為MBC。

1.3.3 菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

參考楊紅等[10]用固體稀釋法設(shè)置0.006 3%～0.40% 7個(gè)濃度梯度的分別含丁香、牛至、桂皮的PDA培養(yǎng)基,無(wú)菌水做空白對(duì)照,倒入平板冷凝。用6 mm打孔器取菌塊,將菌塊放入含植物精油的培養(yǎng)基中央,各濃度重復(fù)2次試驗(yàn),置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h后將平皿倒置,待空白對(duì)照的菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后開(kāi)始測(cè)量。運(yùn)用十字交叉法測(cè)量各平皿菌落直徑,計(jì)算各組試驗(yàn)結(jié)果的平均值,抑菌率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 柑橘打孔貯藏試驗(yàn)

參照孫思明[11]的方法,用2倍稀釋法,設(shè)置0.012 5%～1% 7個(gè)濃度的丁香、牛至、桂皮處理液,選用無(wú)病害的果實(shí),于200 mg/L的NaClO溶液浸泡10 min,再用流水清洗,晾干。將直徑為5 mm的打孔器于柑橘表面刺一個(gè)小孔,加入25 μL不同濃度的處理液,對(duì)照分別加入等量蒸餾水和吐溫80作為普通對(duì)照和吐溫對(duì)照,最后加入菌液15 μL,用保鮮袋包裝置于25 ℃條件下貯藏,于貯藏第4天用十字交叉法測(cè)得其菌孔大小,腐爛面積計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：∑πr2,創(chuàng)傷口面積總和,cm2;n,創(chuàng)傷口總數(shù);r,創(chuàng)傷口的腐爛半徑,cm。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖,采用SPSS 19.0中 Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析,顯著性水平設(shè)置P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 十三種植物精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果

不同植物源精油,對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果也有顯著的差別。各植物精油對(duì)供試菌的抑菌圈大小如表1所示。在13種植物精油中桂皮精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果最佳,其抑菌圈直徑分別為43.11、39.03 mm；其次是牛至和丁香精油,其對(duì)意大利青霉抑菌直徑分別為39.32、35.81 mm,對(duì)指狀青霉抑菌直徑分別為27.89、21.50 mm。八角、鼠尾草和迷迭香精油均對(duì)意大利青霉和指狀青霉具有抑制效果,但顯著低于桂皮、牛至和丁香精油(P<0.05),百里香精油具有與桂皮、牛至和丁香精油同等的抑菌作用。檸檬胺精油僅對(duì)指狀青霉菌起抑制作用,肉豆蔻僅對(duì)意大利青霉菌有抑制作用,而廣藿香、生姜和雪松、甘草精油等對(duì)2種供試菌均無(wú)抑菌作用。如表2所示,桂皮對(duì)意大利青霉和指狀青霉的MIC和MBC值均較小,濃度都為0.012 5%；牛至精油對(duì)意大利青霉的MIC和MBC值均為0.05%,對(duì)指狀青霉的MIC和 MBC值均0.1%；而丁香精油對(duì)意大利青霉的MIC和 MBC值分別為0.05%、0.1%,對(duì)指狀青霉的MIC和 MBC值分別為0.1%、0.2%。另外3種精油對(duì)2種菌的MIC和 MBC值均大于0.4%。在已有報(bào)道中,桂皮和丁香精油的主要成分肉桂醛和丁香酚對(duì)意大利青霉菌有較好的抑制效果[12]。牛至精油的主要成分酚類化合物有較強(qiáng)的天然抗菌作用[13],因?yàn)榘倮锵憔秃泻团Ｖ辆屯瑯拥某煞职倮锵惴?所以百里香精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌效果表現(xiàn)較好。吳克剛等[14]發(fā)現(xiàn)牛至和百里香組合表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效果,SOHYUN等[15]研究發(fā)現(xiàn)肉桂皮,牛至和百里香組合也有協(xié)同抗菌活性。董路路等[16]也表明對(duì)青霉菌的抑菌效果從大到小依次為牛至精油、肉桂精油和丁香精油。

表1 植物精油對(duì)供試菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of plant essential oils on tested bacterias

表2 植物精油對(duì)供試菌的MIC、MBC 單位：%

2.2 丁香、牛至和桂皮精油對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果

由圖1可知,在設(shè)置的7個(gè)濃度中,牛至、桂皮和丁香精油對(duì)意大利青霉菌的抑制作用普遍強(qiáng)于對(duì)指狀青霉的抑制作用。這3種精油對(duì)意大利青霉菌和指狀青霉菌在濃度≥0.1%時(shí),抑菌率達(dá)到100%。0.01%的牛至精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為95.4%和73.0%；當(dāng)濃度升高至0.03%,牛至精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為100%、90.3%。0.01%的桂皮精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為47.0%、14.4%；濃度為0.03%時(shí),對(duì)2種菌的抑菌率分別為64.8%、31.6%；濃度為0.05%時(shí),抑菌率分別為90.9%、75.8%。0.01%的丁香精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌率分別為53.4%、44.9%；濃度為0.03%時(shí),對(duì)2種菌的抑菌率分別為97.0%、76.6%；濃度為0.05%時(shí),抑菌率分別為100%、90.4%。有學(xué)者[17-19]認(rèn)為丁香對(duì)青霉菌抑菌效果好,抑菌譜較寬。蔣志國(guó)等[20]也認(rèn)為丁香抑菌效果好于肉桂,除了對(duì)青霉菌有較好的抑菌作用外,丁香精油還能激發(fā)宿主防御反應(yīng),抑制丙二醛(malonaldehyde,MDA)積累,有效地控制由青霉菌而引發(fā)的柑橘類水果藍(lán)霉病的發(fā)病率[21]。

2.3 柑橘打孔貯藏

牛至、桂皮和丁香精油對(duì)意大利青霉接種柑橘在打孔貯藏第4天時(shí)的腐爛面積見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比,采用精油處理能抑制柑橘的腐爛,其腐爛面積均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。精油濃度在0.012 5%時(shí),各處理組的小孔周圍均出現(xiàn)了腐爛,腐爛面積最大的是牛至(1.04 cm2),其次是丁香(0.71 cm2)、桂皮(0.36 cm2),3種精油處理效果存在顯著性差異(P<0.05)。濃度在0.025%～0.2%時(shí),丁香和牛至樣品的處理孔徑未發(fā)生變化(5 mm),無(wú)腐爛現(xiàn)象。桂皮精油在濃度0.2%以上時(shí),丁香、牛至精油在濃度分別為0.25%、0.5%以上時(shí),出現(xiàn)了不同程度的腐爛(P<0.05)。ELCOCKS等[22]的研究表明肉桂皮精油在濃度>0.5%的情況下,會(huì)在≤6 min發(fā)揮殺菌活性,作用時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)影響處理樣品的品質(zhì)。造成這種現(xiàn)象的原因可能是外源處理物引起角質(zhì)層的變化[23],高濃度的桂皮精油對(duì)柑橘果實(shí)果皮角質(zhì)層造成的破壞更嚴(yán)重,導(dǎo)致果皮角質(zhì)層本身的防止水分流失和抵御微生物侵害等功能喪失,而且張靜等[24]證明角質(zhì)基質(zhì)的含量減少,指狀青霉的菌絲生長(zhǎng)或者是孢子的萌發(fā)會(huì)被促進(jìn)。

a-牛至;b-桂皮;c-丁香圖1 牛至、桂皮和丁香精油對(duì)意大利青霉和指狀青霉的抑菌率Fig.1 Inhibition rate of oregano,cinnamon and clove ssential oil against Penicillium italicum and Penicillium digitatum 注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05),大寫(xiě)字母表示的是意大利青霉,小寫(xiě)字母表示的是指狀青霉

圖2 植物精油對(duì)柑橘貯藏過(guò)程中腐爛面積的影響Fig.2 Effect of plant essential oils on rotten area of citrus during storage 注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

在貯藏期間,指狀青霉組普通對(duì)照第4天的腐爛面積高達(dá)10.19 cm2,第6天為29.96 cm2。桂皮處理的指狀青霉組的腐爛面積高于其他處理組,這與楊文俠等[25]在實(shí)際貯藏中發(fā)現(xiàn)肉桂提取液導(dǎo)致臍橙失重率和腐爛率升高的現(xiàn)象一致,但具體原因不詳。如圖3-b,意大利青霉+牛至精油處理組的腐爛面積最小,但牛至精油的味道較重,致使處理樣品的品質(zhì)較其他組稍差,目前膠囊包埋技術(shù)的應(yīng)用可以降低該精油對(duì)食品品質(zhì)的破壞[26],有學(xué)者[27-29]應(yīng)用植物精油制作保鮮紙或涂膜瓦楞紙箱實(shí)現(xiàn)對(duì)水果的保鮮。在同樣的貯藏時(shí)間內(nèi),指狀青霉組的腐爛面積以及菌絲的生長(zhǎng)速率顯著大于意大利青霉組,這與丁仁慧等[30]的試驗(yàn)貯藏效果相似。指狀青霉的處理腐爛情況如圖3-c,在其打孔部位及菌孔周圍3～4 mm處未出現(xiàn)明顯的菌絲,且菌絲主要生長(zhǎng)部位是柑橘最先變軟的組織。

a-指狀青霉(上-處理組；下-對(duì)照組);b-意大利青霉;c-指狀青霉圖3 牛至處理樣品Fig.3 Oregano treatment samples

3 結(jié)論

結(jié)果表明,在打孔保鮮貯藏期間,指狀青霉菌和意大利青霉菌會(huì)破壞柑橘品質(zhì)導(dǎo)致腐爛加劇。牛至、桂皮、丁香、百里香、鼠尾草和迷迭香等精油對(duì)供試菌有抑制作用,其中抑制作用最強(qiáng)的是桂皮,其次是牛至和丁香。0.1%的牛至、桂皮和丁香精油處理可有效抑制青霉菌在果實(shí)上的生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)該濃度處理的柑橘的腐爛速度明顯降低,可以延長(zhǎng)柑橘的貯藏時(shí)間。

植物精油成分復(fù)雜,不同植物精油內(nèi)可能有相同作用成分,同種植物通過(guò)不同提取方式所得到的精油作用強(qiáng)度也有差異。目前對(duì)于植物精油成分之間的相互作用的研究,植物精油對(duì)于多種菌的共同作用效果的研究較少。在現(xiàn)研究中,植物精油的潛在植物毒性以及強(qiáng)烈的感官特性的研究還不夠深入,所以植物精油保鮮的商業(yè)實(shí)施存在一定的局限性。但人們依舊渴望天然物資資源的利用,植物精油較其他防腐保鮮試劑還是更加有優(yōu)勢(shì),值得更加深入的研究。