提取櫻桃中植物病毒RNA方法的建立與優(yōu)化

劉杰,于成明,陳芳龍,郭靜靜,IDA BAGUS ANDIKA,曹欣然*

提取櫻桃中植物病毒RNA方法的建立與優(yōu)化

劉杰1,于成明2,陳芳龍1,郭靜靜1,IDA BAGUS ANDIKA1,曹欣然1*

1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109 2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東 泰安 271018

RNA提取是現(xiàn)代分子生物學(xué)中的一項(xiàng)常用技術(shù)，是后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。櫻桃樣品中富含大量的糖類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)富含降解RNA酶，為提取高質(zhì)量的RNA帶來(lái)了極大的困難。為探尋能夠提取櫻桃中高質(zhì)量RNA以滿(mǎn)足Northern Blot等分子實(shí)驗(yàn)的要求，對(duì)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常用的RNA提取方法進(jìn)行了篩選和歸納，進(jìn)行優(yōu)化并同商品化試劑盒進(jìn)行了比較和評(píng)價(jià)分析。結(jié)果表明：盡管適用于櫻桃RNA提取的方法有很多，但其在提取櫻桃總RNA的效果各有不同，試劑盒B提取的RNA質(zhì)量好，改良SDS法可以提取出純度高且量大的櫻桃總RNA，改良CTAB法次之。

櫻桃; 植物病毒; 提取RNA

提取核酸和蛋白質(zhì)是分子生物學(xué)中最基礎(chǔ)但也是最關(guān)鍵的方法。它是后續(xù)實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)(包括診斷試劑盒)的起點(diǎn)[1]。提取高質(zhì)量的RNA對(duì)于Northern雜交實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要[2-4]，分離出的核酸質(zhì)量和完整性將直接影響所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[5]。常見(jiàn)的分離提取試劑有SDS和CTAB兩種；同時(shí)在富集核酸時(shí)也可以使用Oligo(dT)富集柱[6]和功能化磁珠[7]等方法。高質(zhì)量的核酸應(yīng)不含污染物，常見(jiàn)的污染物包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)或酚類(lèi)等[1]，可通過(guò)添加還原劑、螯合劑、氧化抑制劑等方法去除酚類(lèi)化合物，可通過(guò)鹽酸胍、低濃度乙醇、高濃度NaCl等去除多糖，可通過(guò)加入蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì)[4]。

櫻桃(Sweet Cherry)為薔薇科櫻屬落葉果樹(shù)，櫻桃葉片與根莖組織內(nèi)多糖、多酚及色素等次生代謝物質(zhì)含量很高，提取RNA時(shí)受這些成分的干擾嚴(yán)重[8]。同時(shí)櫻桃組織中核糖核酸酶含量較高，提取過(guò)程中RNA易降解；組織中含水量高，導(dǎo)致核酸濃度低等問(wèn)題[9]。常規(guī)提取方法不能有效去除櫻桃中富含的多糖多酚等雜質(zhì)，不能有效抑制RNA酶的分解，導(dǎo)致提取的RNA不能適用于Northern雜交等后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)改良傳統(tǒng)的SDS與CTAB法，使其適用于櫻桃葉片的高質(zhì)量RNA提取，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可為提取其他植物組織材料中也富含多糖多酚類(lèi)的RNA提供參考指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

櫻桃葉片采集自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)城陽(yáng)校區(qū)附近果園

1.2 試劑

RNA Extraction Buffer:0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8）、0.01 mol/L EDTA、0.5 % SDS、0.05 mol/L NaCl；CTAB:2 % (w/v)CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8)、0.02 mol/L EDTA、1.4 mol/L NaCl；8 mol/L LiCl；3 mol/L NaAC （pH=5.2）；5 mol/L KAC （pH=5.8）；無(wú)水乙醇；5 mol/L NaCl；DEPC 處理過(guò)的 ddH2O；異丙醇；酚仿（苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1）；氯仿異戊醇（氯仿:異戊醇=24:1）；PVP；PVPP；β-巰基乙醇；以上所有試劑均為分析純。試劑A：AG RNAex Pro Reagent購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；試劑B：TAKARA RNAiso plus購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；試劑C：TAKARA RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；試劑盒A：TRANS TransZol Plant購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；試劑盒B：TIANGEN RNA Easy Fast Plant Tissue Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；試劑盒C：AG SteadyPure Qiuck RNA Extraction Kit購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 RNA提取方法

傳統(tǒng)SDS法：傳統(tǒng)SDS法沿用同實(shí)驗(yàn)室Andika等[10]的方法。傳統(tǒng)CTAB法：傳統(tǒng)CTAB提取方法參考河北農(nóng)業(yè)大學(xué)張愷愷等[11]的方法。商品化RNA提取試劑方法參照各自說(shuō)明書(shū)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將RNA提取過(guò)程分為研磨提取過(guò)程、抽提雜質(zhì)過(guò)程、沉淀過(guò)程、三個(gè)部分。根據(jù)這三個(gè)過(guò)程，設(shè)計(jì)單因素變量進(jìn)行RNA提取方法優(yōu)化。

1.4.1提取過(guò)程優(yōu)化使用RNA Extraction Buffer作為提取液，又分別加入（1）1 %體積的β-巰基乙醇[12]；（2）0.2 g PVP[13]；（3）0.02 g PVPP[12]；（4）1 %體積的β-巰基乙醇和0.2 g PVP[12,14,15]；（5）1 %體積的β-巰基乙醇和0.02 g PVPP[9]；（6）0.2 g PVP和0.02 g PVPP；（7）1 %體積的β-巰基乙醇、0.2 g PVP和0.02 g PVPP[16]七組以及對(duì)照組，其余步驟相同。使用CTAB作為提取液，也同樣添加以上7組試劑以及對(duì)照組，其余步驟相同。

1.4.2 抽提過(guò)程優(yōu)化使用RNA Extraction Buffer作為提取液，在抽提時(shí)分別采用以下方式進(jìn)行：（1）氯仿抽提1次；（2）氯仿異戊醇（24:1）抽提1次；（3）酚仿（25:24:1）抽提1次；（4）酚仿抽提1次，氯仿抽提1次；（5）酚仿抽提1次，氯仿異戊醇抽提1次；（6）酚仿抽提兩次；（7）酚仿抽提1次，取上清加入1/2體積NaCl和1/2體積氯仿異戊醇抽提1次[17,18]；（8）酚仿抽提1次，取上清加入1/3體積KAC混勻冰浴30 min，加入等體積氯仿異戊醇抽提1次；（9）酚仿抽提1次，取上清加入1/10體積KAC和1/5體積無(wú)水乙醇冰浴30 min，加入等體積氯仿異戊醇抽提1次。使用CTAB作為提取液，也同樣添加以上9組試劑，其余步驟相同。

1.4.3 沉淀過(guò)程優(yōu)化沉淀過(guò)程分別對(duì)沉淀試劑和沉淀方法進(jìn)行優(yōu)化；沉淀試劑分別使用異丙醇-NaAC和LiCl，其余步驟相同；沉淀方式分別采用離心管沉淀和富集柱沉淀，其余步驟相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取過(guò)程

使用RNA Extraction Buffer時(shí)，添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP的處理提取效果最好，添加PVPP和β-巰基乙醇效果次之；使用RNA Extraction Buffer所有處理中，添加β-巰基乙醇效果明顯優(yōu)于未添加的處理。當(dāng)使用CTAB時(shí)，添加PVP和PVPP的處理提取效果最好，添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP的處理次之，在使用CTAB的所有處理中含有PVPP的處理均優(yōu)于未添加PVPP的處理。在相同處理?xiàng)l件下，使用CTAB作為提取緩沖液的RNA濃度高于使用RNA Extraction Buffer。

2.2 抽提過(guò)程

當(dāng)使用RNA Extraction Buffer 時(shí)，進(jìn)行兩次酚仿抽提的處理效果最好，進(jìn)行一次酚仿抽提，一次氯仿異戊醇抽提的處理次之；對(duì)于所有處理，兩次抽提效果明顯優(yōu)于一次抽提效果，但兩次抽提會(huì)損耗部分RNA。使用CTAB處理結(jié)果與RNA Extraction Buffer結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)此次優(yōu)化后，抽提兩次后，使用CTAB的處理RNA損耗高于使用RNA Extraction Buffer的處理。

2.3 沉淀過(guò)程

使用RNA Extraction Buffer處理中，使用LiCl作為沉淀試劑的效果明顯優(yōu)于使用異丙醇-NaAC。當(dāng)使用CTAB處理中，使用LiCl作為沉淀試劑的效果略低于使用異丙醇-NaAC。

使用富集柱法的處理中，其RNA質(zhì)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但使用富集柱法的處理中，離心時(shí)間縮短，沉淀溶解時(shí)間縮減，可大幅縮短沉淀時(shí)間。

2.4 最終優(yōu)化方案

改良SDS法提取過(guò)程中使用RNA Extraction Buffer同時(shí)添加β-巰基乙醇、PVP和PVPP；抽提過(guò)程使用兩次酚仿抽提；沉淀過(guò)程使用LiCl作為沉淀試劑。改良CTAB法提取過(guò)程中使用CTAB同時(shí)添加PVP和PVPP；抽提過(guò)程使用兩次酚仿抽提；沉淀過(guò)程使用異丙醇作為沉淀試劑。結(jié)果顯示，改良SDS法與改良CTAB法均優(yōu)于傳統(tǒng)SDS法和傳統(tǒng)CTAB法，且在所有組別中改良SDS法最優(yōu)，改良CTAB法次之。在商品化試劑中，試劑盒B最優(yōu)。

圖1 RNA質(zhì)量比較

注：使用1 %TAE瓊脂糖凝膠，點(diǎn)入等量的樣品進(jìn)行電泳。依據(jù)膠圖樣品順序，在研磨樣本量均為0.2 g的條件下，使用微量分光光度計(jì)測(cè)量濃度，結(jié)合加水量計(jì)算RNA提取總量，RNA提取量=RNA濃度×加水量。

Note: We used 1% TAE agarose gel and added equal volume samples. According to the order of the samples on the gel picture, under the condition that the sampling quantities were 0.2 g, we measured the concentration with a micro spectrophotometer, and calculated the total RNA extracted quantity considered with the amount of water added. RNA extraction quantity = RNA concentration × Amount of water added.

3 討論

提取高質(zhì)量的RNA是Northern Blot的核心關(guān)鍵步驟。植物組織中存在的蛋白質(zhì)、多糖多酚以及其他次生代謝物質(zhì)嚴(yán)重影響了RNA的提取，尤其是甜櫻桃葉片組織中富含多糖多酚。在植物細(xì)胞空間內(nèi)，這些物質(zhì)是與核酸分離的，但當(dāng)植物細(xì)胞被研磨破碎后，這些物質(zhì)就會(huì)與RNA產(chǎn)生相互作用[19]。酚類(lèi)化合物被氧化后會(huì)與RNA結(jié)合，該過(guò)程不可逆，并會(huì)導(dǎo)致RNA的活性喪失；多糖會(huì)與RNA共沉淀形成難溶的膠狀物；無(wú)論內(nèi)源還是外源的RNase均會(huì)造成RNA的降解；同時(shí)細(xì)胞中的次級(jí)代謝產(chǎn)物極易與RNA結(jié)合，從而阻礙RNA的分離。因此能否有效地去除甜櫻桃葉片中多糖、酚類(lèi)化合物、RNase和其它代謝產(chǎn)物是能否提取到高質(zhì)量RNA的關(guān)鍵[19-22]。

本實(shí)驗(yàn)中使用傳統(tǒng)SDS法的樣品濃度最高，但條帶降解較重；改良SDS法的樣品濃度與傳統(tǒng)SDS法差別不大，并且條帶完整，非常適合后續(xù)核酸分子雜交試驗(yàn)；試劑盒B雖然條帶完整性較好，但其濃度較低；傳統(tǒng)SDS法與傳統(tǒng)CTAB法濃度相對(duì)較高，RNA條帶降解嚴(yán)重，均不能滿(mǎn)足Northern Blot要求。其他試劑雖然濃度相對(duì)較高，但是條帶幾乎不可見(jiàn)，推測(cè)是RNA降解導(dǎo)致，但可以滿(mǎn)足RT-PCR及常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。吸附柱的沉淀方法對(duì)于RNA質(zhì)量并無(wú)明顯提升，但是可以有效減少RNA沉淀過(guò)程的耗時(shí)。

本研究?jī)?yōu)化出改良SDS法，可提取出櫻桃樣品中高質(zhì)量的RNA，RNA完整性較好，濃度高，可滿(mǎn)足后續(xù)Northern雜交。改良SDS法比天根試劑盒性?xún)r(jià)比高，但總提取時(shí)間較長(zhǎng)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室具體情況進(jìn)行選擇。尤其在進(jìn)行大批量Northern雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，更適宜選擇改良SDS法。若RT-PCR等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，也可以選擇傳統(tǒng)方法和商品化試劑。若進(jìn)行快速檢測(cè)時(shí)，商品化試劑盒更為適合?？偠灾?，該RNA提取方法的建立為櫻桃樣品的分子生物學(xué)研究提供了的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他富含多糖多酚的植物材料的RNA提取有提供了借鑒。

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Establishment and Optimization of the Method Extracting the Virus RNA from Sweet Cherry

LIU Jie1, YU Cheng-ming2, CHEN Fang-long1, GUO Jing-jing1, IDA BAGUS ANDIKA1, CAO Xin-ran1*

1.266109,2.271018,

RNA extraction is a common technology in modern molecular biology and the basis of subsequent experiments. Sweet cherry samples are rich in carbohydrate and phenolic compound, as well as RNase, which brings great difficulties to extract high-quality RNA. In order to explore the extraction of high-quality RNA from cherry for the requirements of Northern blot and other molecular experiments. During recent years the commonly used domestic and international RNA extraction methods were screened and summarized. We also optimized the RNA extraction methods, and the RNA extraction methods were compared with the commercial RNA extraction kit. The results showed that although there are many methods for extracting plant virus RNA from sweet cherry, the effects of extracting total RNA were different. The quality of RNA extracted by kit B is good. The improved SDS method can extract total RNA with the highest purity and quantity. The improved CTAB method is less effective than the improved SDS method.

Sweet cherry; plant virus; RNA extraction

[Q939.46]

A

1000-2324(2021)06-0922-04

2021-06-08

2021-07-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(32001867,31970159);山東省自然科學(xué)基金(ZR2020QC129)

劉杰(1994-),男,碩士研究生,研究方向:分子植物病毒學(xué). E-mail:904328951@qq.com

通訊作者:Author for correspondence. E-mail:xinran1001@163.com