IDO1和IL-10在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系研究*

彭麗娜，武川軍，馮志星，趙倩

（邯鄲市中心醫(yī)院 耳鼻喉科，河北 邯鄲056001）

原發(fā)性喉癌以喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC）最為常見，患者以聲嘶、咳嗽、呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)，早期確診并根據(jù)個(gè)體化病情采取合理的治療方案是提升患者5年生存率的最可靠方式[1-2]。腫瘤細(xì)胞迅速增殖、侵襲、遷移等是導(dǎo)致患者生存時(shí)間短、預(yù)后不良的重要因素，故尋找腫瘤惡性演進(jìn)過程中扮演重要角色的分子是后續(xù)靶向治療的基礎(chǔ)，對(duì)早期明確腫瘤惡性程度及治療方案的選擇具有重要意義。吲哚胺2，3-雙加氧酶1（indoleamine 2, 3-dioxygenase 1, IDO1）是肝外色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝過程中的一種限速酶，已被證實(shí)在宮頸癌[3]、食管癌[4]等惡性腫瘤組織中呈異常高表達(dá)，并且參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移等過程，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。 白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）是腫瘤發(fā)生過程中重要的免疫抑制因子，IL-10 在甲狀腺癌[5]、胰腺癌[5]等腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控、免疫逃逸、遷移等過程，與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)。目前關(guān)于IDO1、IL-10 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其對(duì)疾病預(yù)后的影響研究不多，本次研究以此為切入點(diǎn)展開分析，旨在明確檢測(cè)IDO1、IL-10 表達(dá)在LSCC 病情評(píng)估、預(yù)后判斷中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月—2017年7月邯鄲市中心醫(yī)院進(jìn)行喉部腫瘤切除術(shù)治療且術(shù)中病理確診為LSCC 的患者89 例作為研究對(duì)象。其中，男性48例，女性41 例；年齡32～78 歲，平均（59.38±8.21）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為21～27 kg/m2，平均（24.03±2.17）kg/m2。術(shù)中留取患者的LSCC 組織及癌旁組織標(biāo)本各89 份。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合LSCC 診斷，首次確診并接受治療、既往無相關(guān)病史；②根治性手術(shù)前無放化療等保守治療；③合并喉部嚴(yán)重感染性疾病；④年齡18～80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)性喉癌、喉腺癌；②合并其他原發(fā)惡性腫瘤疾??；③妊娠或者哺乳期女性；④拒絕接受隨訪者。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本組織中IDO1、IL-10 表達(dá)

所有標(biāo)本組織均離體后2 h 內(nèi)放入4%甲醛中固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)病理蘇木精-伊紅染色。常規(guī)石蠟切片，每張切片厚4 μm。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本組織中IDO1、IL-10 的表達(dá)。免疫組織化學(xué)試劑盒購自上海西唐生物科技公司，具體操作按試劑盒說明書步驟進(jìn)行。一抗為鼠抗人單克隆抗體（濃度1∶30），每次染色均使用PBS 作為一抗的陰性對(duì)照。在高倍顯微鏡下觀察可見，LSCC組織細(xì)胞中IDO1、IL-10 分別定位于胞質(zhì)、胞核，呈淺黃色及棕褐色顆粒染色。單個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10 個(gè)視野。染色面積計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無著色為0分，＜25%著色為1 分，25%～50% 著色為2 分，＞50%著色為3 分；染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：不顯色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。表達(dá)陽性情況以染色面積積分+染色強(qiáng)度積分進(jìn)行判斷，設(shè)0分為“-”，1～2分為“+”，3～4 分為“++”，5～6 分為“+++”。將“+”“++”“+++”均判定為陽性。

1.4 隨訪

采用門診或住院復(fù)查、電話回訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪終點(diǎn)為2019年9月1日或者患者死亡時(shí)間點(diǎn)，記錄平均生存時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制Kaplan-Meier 生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗(yàn)；采用Cox 多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析預(yù)后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCC 組織與癌旁組織中IDO1 和IL-10 表達(dá)陽性率的比較

LSCC 組織中IDO1 表達(dá)陽性率與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LSCC 組織高于癌旁組織；LSCC 組織中IL-10 表達(dá)陽性率與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LSCC 組織高于癌旁組織。見表1 和圖1。

圖1 LSCC組織及其癌旁組織中IDO1、IL-10表達(dá) （HTC×400）

表1 LSCC組織與癌旁組織中IDO1和IL-10表達(dá)陽性率的比較 [n=89，例（%）]

2.2 不同臨床病理特征LSCC 患者IDO1 和IL-10表達(dá)陽性率的比較

不同TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的LSCC 患者IDO1、IL-10 表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤位置的LSCC 患者IDO1、IL-10表達(dá)陽性率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征LSCC患者IDO1和IL-10表達(dá)陽性率的比較 例（%）

2.3 IDO1 和IL-10 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

繪制Kaplan-Meier 生存曲線并進(jìn)行Log rank χ2檢驗(yàn)，與IDO1、IL-10 陰性患者比較，IDO1、IL-10陽性患者的總生存時(shí)間明顯縮短（P＜0.05）。截至到隨訪時(shí)間，IDO1 陽性組的術(shù)后總生存率為35.09%（20/57）、術(shù)后中位生存時(shí)間為24 個(gè)月，IDO1 陰性組的術(shù)后總生存率為46.88%（15/32）、術(shù)后中位生存時(shí)間為35 個(gè)月。兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.015，P=0.014）。IL-10 陽性組的術(shù)后總生存率為32.81%（21/64）、術(shù)后中位生存時(shí)間為27 個(gè)月，IL-10 陰性組的術(shù)后總生存率為48.00%（12/25）、術(shù)后中位生存時(shí)間為33 個(gè)月。兩組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.164，P=0.023）。見圖2。

圖2 IDO1、IL-10陽性表達(dá)與IDO1、IL-10陰性表達(dá)患者的生存曲線

2.4 LSCC患者預(yù)后的影響因素分析

建立Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以TNM 分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、IDO1、IL-10為自變量，以預(yù)后狀況為因變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期，其他各變量賦值見表3。采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α入=0.05，α出=0.10。Cox 回歸結(jié)果顯示，TNM 分期較高[=1.351（95% CI：1.055，1.730）]、分化程度較低[=0.734（95% CI：0.562，0.959）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=1.448（95%CI：1.095，1.915）]、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[=1.246（95%CI：1.035，1.500）]、IDO1 陽性表達(dá)[=1.575（95% CI：1.156，2.146）]、IL-10 陽性表達(dá)[=1.771（95% CI：1.250，2.508）]是LSCC 患者預(yù)后的 影響因素（P＜0.05）。見表3。

表3 LSCC患者預(yù)后影響因素的Cox多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型參數(shù)

3 討論

LSCC 惡性程度較高，早期易出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命安全[7]。有研究指出免疫逃逸在LSCC 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，故明確對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生關(guān)鍵性影響作用的分子可能對(duì)日后的治療具有重要意義[8]。IDO1異常高表達(dá)可促使細(xì)胞中色氨酸耗竭，使多種細(xì)胞失去正常功能，并且抑制免疫細(xì)胞增殖，對(duì)機(jī)體正?？鼓[瘤免疫功能產(chǎn)生負(fù)面影響[9-10]。IL-10 也是一種重要的免疫抑制因子，通過促進(jìn)Th2 細(xì)胞增殖、抑制Th1 細(xì)胞增殖、抑制APC抗原遞呈功能，最終影響細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤的識(shí)別[11-13]。關(guān)于IDO1、IL-10 在LSCC 組織中的表達(dá)已有初步報(bào)道[14-15]，但關(guān)于上述分子對(duì)LSCC 病情及預(yù)后的影響研究涉及不多。鑒于這一現(xiàn)狀，本研究以LSCC 組織中IDO1、IL-10 的表達(dá)為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)LSCC 組織中IDO1、IL-10 的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，這一結(jié)果說明IDO1、IL-10的異常高表達(dá)參與了LSCC的發(fā)生、發(fā)展。

臨床病理特征可從不同方面客觀反映患者病情嚴(yán)重程度，故衡量蛋白表達(dá)情況與病理特征的相關(guān)性可間接說明該蛋白對(duì)病情嚴(yán)重程度的影響[16-17]。文中根據(jù)腫瘤組織中IDO1、IL-10的表達(dá)陽性與否對(duì)入組患者進(jìn)行二次分組，通過比較其性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素后發(fā)現(xiàn)：TNM分期高、分化程度低、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者IDO1、IL-10 陽性表達(dá)率更高，說明高表達(dá)的IDO1、IL-10 是LSCC 惡性程度高的重要標(biāo)志，與既往研究所述IDO1、IL-10在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的作用吻合。IDO1、IL-10表達(dá)增加后可對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)造成不同程度抑制，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，并加速病情進(jìn)展，這可能是高表達(dá)IDO1、IL-10的LSCC患者病理特征不理想的核心原因之一。

本研究對(duì)入組患者進(jìn)行術(shù)后長期隨訪并發(fā)現(xiàn)，IDO1、IL-10 陽性表達(dá)者生存時(shí)間較短，說明IDO1、IL-10 高表達(dá)對(duì)LSCC 患者的遠(yuǎn)期生存具有負(fù)面作用。使用Cox 多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型探討對(duì)LSCC 患者生存時(shí)間產(chǎn)生直接影響的因素，發(fā)現(xiàn)較高的TNM 分期、較低的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、IDO1 陽性表達(dá)、IL-10陽性表達(dá)均是縮短患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。該結(jié)果推測(cè)與IDO1、IL-10 高表達(dá)后促進(jìn)LSCC 病情進(jìn)展相關(guān)。IDO1、IL-10 表達(dá)陽性與LSCC惡性程度以及患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示可以將IDO1、IL-10 應(yīng)用到LSCC 的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估當(dāng)中，并且早期聯(lián)合檢測(cè)有助于預(yù)測(cè)LSCC 的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，從而為臨床制訂針對(duì)性干預(yù)方案提供參考。

綜上所述，LSCC 組織中IDO1、IL-10 表達(dá)陽性率較癌旁組織異常升高，且陽性表達(dá)患者的TNM 腫瘤分期較高、分化程度較低、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的比例較高，同時(shí)是導(dǎo)致患者遠(yuǎn)期生存時(shí)間縮短的危險(xiǎn)因素之一。IDO1、IL-10表達(dá)可能是影響LSCC 發(fā)生、發(fā)展的重要分子之一，干擾其表達(dá)對(duì)疾病病情及預(yù)后的影響研究有望在日后進(jìn)一步展開。