櫻桃根頸腐爛病病菌分離鑒定

李淑平 張 偉 王新語 李 晶 張煥春*

（1山東省煙臺市農業(yè)科學研究院，煙臺 265500；2煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005）

甜櫻桃是我國北方種植經濟效益最高的樹種之一，我國從20世紀80年代開始引種栽培，目前全國栽培面積超過13.5萬hm2。櫻桃根頸腐爛病是櫻桃生產中的一種致死病害，在櫻桃的新老產區(qū)均有發(fā)生，嚴重影響櫻桃的產量和品質。本研究在櫻桃的主產區(qū)煙臺，以患根頸腐爛病櫻桃樹為試材，對其病原菌進行分離、鑒定，以期為該病害的田間防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在山東煙臺的蓬萊、福山區(qū)、牟平區(qū)等櫻桃主產地，共8個采樣點，選擇櫻桃根頸腐爛病樹，切取病健交界的皮層和木質部組織，放入干凈的采集袋內，帶回實驗室分離培養(yǎng)。

1.2 病菌分離

在超凈臺上，先切取較大病斑組織 （1 cm左右小塊），置于70%乙醇中浸3～5 min，再將病斑組織移入0.1%HgCl2溶液中浸3～5 s，消毒后切取病斑組織中央部分，經滅菌水漂洗3次后，轉移到PDA培養(yǎng)基上，放入生化培養(yǎng)箱，25℃培養(yǎng)。

1.3 r-DNA-ITS序列分析

利用改良CTAB法提取致病病菌DNA，采用ITS4 （5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′）和TTS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAGAAG-3′）作為通用引物。按常規(guī)應體系50 μL：10×PCR buffer 5 μL，Taq 酶 1 μL，dNTP 1 μL，上游引物1 μL， 下游引物 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 40 μL。 擴增條件：94 ℃預變形性 5 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個循環(huán)；最終72℃延伸10 min。

回收PCR產物，將目的片段連接到載體Pmd19-T Vector上，進行轉化，挑選PCR檢測為陽性的菌落，接種到Amp+LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min 37℃搖菌過夜，按質粒提取試劑盒小量提取質粒。用pMD19-T載體引物M13（-47）和 M13（-48）雙向測序，測序結果拼接，于 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/上 BLAST 比對。

1.4 致病性測定

供試植物為2年生美早櫻桃苗，試驗部位為根頸處，接種時間為6月份。先用滅菌棉棒蘸取滅菌水把試驗部位擦凈、晾干，再用75%酒精消毒、晾干。用縫衣針針刺需接種部位，1 cm2約刺10個孔。以5 mm打孔器在培養(yǎng) 3 d的供試菌株菌落邊緣打取菌餅作為接種體。接種菌餅后，用滅菌棉球蘸無菌水覆蓋接種部位，外纏保鮮膜保濕。對照處理不接種菌餅，其它步驟相同。用紅色油漆筆標記接種部位。每個處理5株。保濕48 h后，拆除保鮮膜，接種部位用濕潤的土覆蓋，并經常檢查確保濕潤。2個月后觀察發(fā)病情況。確定發(fā)病的植株，再采集病樣進行分離、鑒定。與接種病菌分子鑒定結果相同的，確定為致病菌。

2 結果與分析

2.1 病菌分離鑒定

將煙臺的8個櫻桃根頸腐爛病發(fā)病地點采集到的病樣經分離純化，得到10個菌株，經致病性測定及分子鑒定，結果見表1。

表1 8個櫻桃采樣點病菌分離鑒定情況

有8個菌株可引起發(fā)?。?株撕裂蠟孔菌，1株赤球叢赤殼，1株粗毛栓菌屬白腐菌，3株擬莖點霉屬病菌，2株尖孢鐮刀菌。另鑒定到木霉 菌 屬 （Trichoderma album） 和 糞 殼 菌 綱（Sordariomycetes）各 1株，不能引起發(fā)病。

2.2 病菌培養(yǎng)特征

5種病菌在PDA培養(yǎng)條件下，均未產生孢子。25℃暗培養(yǎng)4 d，各菌落形態(tài)如圖1。赤球叢赤殼菌落白色，菌絲絨毛狀細密，均勻，菌落直徑為3.8 cm。擬莖點霉屬菌落白色，致密，菌落正面高低不平，菌落直徑為7.8 cm。撕裂蠟孔菌菌落白色，菌絲稀疏，菌落直徑為7.4 cm。粗毛栓菌屬白腐菌，菌落白色，呈射軸狀，疏密相間，菌落直徑為6.5 cm。尖孢鐮刀菌菌落正面白色，反面粉紅色，菌絲絨毛狀，細密均勻，菌落直徑為3.9 cm。

圖1 引起櫻桃根頸腐爛病的病菌

2.3 致病性測定

在夏季高溫多雨季節(jié)，櫻桃接種病菌，1個月后可發(fā)現根頸部位有白色菌絲纏繞。刮開樹皮，可見病菌由針刺部位侵染，圍繞針刺點縱深發(fā)展。前期預備試驗顯示，如沒有刺傷，接種病菌后1年仍未表現出病癥，說明病菌主要從傷口侵入。

接種2個月后調查，對照只在針刺點形成褐色疤痕，周圍腐爛狀，但并不深入。接種病菌的樹體，外表被白色菌絲纏繞，刮開樹皮后，已分辨不出接種的針刺孔，病組織相連，和田間櫻桃根頸腐爛病樹癥狀相似。

圖2 5種真菌在櫻桃苗上的接種效果

3 討論與結論

櫻桃根頸腐爛病在櫻桃產區(qū)時有發(fā)生，輕者影響果實品質，嚴重的造成整株樹死亡。根據多點采樣分析及分子鑒定，確定有5種真菌可造成櫻桃根頸腐爛，即尖孢鐮刀菌、擬莖點霉屬菌、粗毛栓菌屬白腐菌、赤球叢赤殼和撕裂蠟孔菌。

擬莖點霉屬和尖孢鐮刀菌這兩類病菌，在國內多有報道。擬莖點霉屬是重要的植物病原，可引起潰瘍、爛莖、果腐、葉枯、枝枯、根腐、樹皮壞死等多種癥狀[1-2]。尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的病原真菌，寄主范圍廣泛，可引起100多種植物維管束萎蔫病害[3-4]。由本實驗分離鑒定結果可知，引起櫻桃根頸腐爛病的病菌中，8個發(fā)病點，有3個點分離到擬莖點霉屬菌，占37.5%；2個點分離到尖孢鐮刀菌，占25%。

呂勁峰等[5]在廣東雞蛋果上報道發(fā)現了赤球叢赤殼，稱該病原菌主要侵害根、莖交界處，橫切病莖可見木質部變褐，可引起大量植株迅速凋萎死亡。

關于粗毛栓菌屬白腐菌的文章，大多為此菌在造紙中用來生物降解纖維的應用研究，Milenkovic M等[6]報道，此菌在埃塞俄比亞可引起泡桐衰退病。Jelena等[7]利用此菌來降解木質素。目前國內沒有此菌引起病害的報道。

關于撕裂蠟孔菌，李淑平[8]前期發(fā)表的文章有所介紹。通過后續(xù)4種病菌的發(fā)現，說明引起櫻桃根頸腐爛的病原不同，但發(fā)病癥狀相似。推測或許還有其它病菌可引起此病。而且，試驗中發(fā)現，只有針刺接種，才可以導致發(fā)病，說明這幾種病菌是通過傷口侵染，因此在櫻桃的生產管理中，為防止根莖腐爛病的發(fā)生，要保護好根頸部位，盡量避免造成傷口。這也解釋了為什么冬天凍害嚴重年份，翌年此病大爆發(fā)，是因為凍害造成了傷口，利于病菌的侵染。