妊娠期糖尿病新型候選生物標志物的篩選研究

黃萍萍，葛 莉*，繆海燕，于紅虹，吳冬梅，賴玉婷，江心泳，王冠東，陳 凡

1.福建中醫(yī)藥大學護理學院,福建 350122；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期最常見的代謝紊亂。2019 年數(shù)據(jù)顯示，全球約有15.8%的孕婦存在不同程度的高血糖，其中GDM 占83.6%[1]。持續(xù)增長的GDM 患病率對世界公共衛(wèi)生問題構(gòu)成了嚴重的威脅，不僅對孕產(chǎn)婦與子代的近遠期健康具有潛在的影響[2-4]，還給醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟負擔[5]。由于GDM 篩查診斷主要在妊娠中晚期，使得早期防護缺乏針對性，一旦確診則干預治療的時間有限[6]，且目前尚未篩選出公認具有臨床價值的生物標志物。因此，獲知GDM 的發(fā)病機制，尋求靈敏度高、特異性強的生物標志物用于早期篩查已經(jīng)成為產(chǎn)科領域研究的一個重點。已知GDM 是胎盤起源的疾病，本課題組前期通過同位素標記的相對與絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)的定量蛋白組學結(jié)合平行反應監(jiān)測(parallel reaction monitoring，PRM)技術篩選與驗證出外血小板溶素1(epiplakin，EPPK1)、冷誘導RNA 結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRBP)、不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1)、不均一核糖核蛋白AB(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B，HNRNPAB)、不均一核糖核蛋白L(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，HNRNPL)、RAS 癌基因家族成員RAB21(ras-related protein Rab-21，RAB21)、RAS癌基因家族成員RAB3B(ras-related protein Rab-3b，RAB3B)7 個蛋白在GDM 組胎盤組織中表達顯著上調(diào)。由于胎盤蛋白與GDM 的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系[7-8]，妊娠期間母體外周血循環(huán)中存在與胎盤相關和(或)胎盤組織釋放入血的蛋白[9]，且關于胎盤蛋白的GDM 早期篩查指標的研究處于起步階段。因此，本研究通過酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測這7 個胎盤蛋白是否在孕婦外周血清中有表達且是否與在胎盤中的表達趨勢一致，從而篩選出候選生物標志物，為后續(xù)臨床縱向隊列驗證和生物標志物開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019 年7 月—2019 年10 月在福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院產(chǎn)科門診常規(guī)產(chǎn)檢及住院分娩的GDM 孕婦30 例為病例組(GDM 組)，同期選取年齡、孕周等指標與GDM 組相匹配的正常糖耐量孕婦30 例為對照組。本研究通過福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（批件號：2018-KL024-02），并且所有的研究對象均簽署紙質(zhì)版知情同意書。納入標準：①符合GDM 診斷標準[10]的妊娠37～42 周的孕婦；②無其他妊娠合并癥；③經(jīng)產(chǎn)婦既往無GDM 病史。排除標準：①孕前有高血壓、先天性心臟病及肝腎功能不全病史；②合并多囊卵巢綜合征及垂體、腎上腺及甲狀腺等功能異常的內(nèi)分泌疾病；③多胎妊娠、早產(chǎn)、胎兒畸形、胎兒宮內(nèi)生長受限或死胎；④使用皮質(zhì)激素類藥物或近1 周使用影響糖脂代謝的藥物；⑤產(chǎn)前發(fā)熱或近期有炎癥、感染及創(chuàng)傷等其他應激狀態(tài)；⑥產(chǎn)檢及分娩資料不完整的孕產(chǎn)婦或既往有煙酒不良嗜好的孕產(chǎn)婦。

1.2 資料收集

1.2.1 一般指標 記錄兩組研究對象24～28 周口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）血糖值、糖化血紅蛋白(HbA1c)值、年齡、孕次、產(chǎn)次、分娩方式等指標，由專人測量研究對象產(chǎn)前體重、身高，計算產(chǎn)前體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。

1.2.2 外周血標本 所有孕婦均于孕37～42 周入院待產(chǎn)期間抽取清晨空腹肘靜脈血2 mL 置促凝管中，血標本于1 h 內(nèi)在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，將1 mL 血清分裝為4 管后置于—80 ℃冰箱保存待測。

1.2.3 ELISA 檢測篩選候選生物標志物 根據(jù)試劑盒說明書稀釋標準品；設置空白孔(不加樣品和酶標試劑)、標準孔和樣品孔，標準孔內(nèi)加入不同濃度的標準品50 μL，樣品孔先后加入樣本稀釋液40 μL 和樣品10 μL；用封板膜封板后于37 ℃孵育30 min；棄掉液體拍干并加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去、拍干，重復5 次；除空白孔外，其他加入酶標試劑50 μL 后37 ℃孵育30 min；再次洗滌5 次后，每孔加入顯色劑A、顯色劑B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min；每孔加入終止液50 μL，在15 min 內(nèi)用450 nm 波長測量各孔的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，Graph Pad Prism 8 作繪圖分析。定量資料符合正態(tài)分布時用均數(shù)±標準差（±s）表示，進行兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布時先進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，若仍然呈非正態(tài)分布則進行非參數(shù)檢驗，數(shù)據(jù)用中位數(shù)(M)、四分位數(shù)間距(IQR)表示。對非等級定性資料進行χ2檢驗。對篩選出的候選生物標志物指標進行二元Logistic 回歸分析，選擇對GDM 發(fā)生有顯著影響的蛋白指標，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)分析其對診斷GDM 的敏感性、特異性和截斷值。P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象臨床資料比較 GDM 組孕婦在孕24～28 周進行75 g OGTT 檢測血糖的0 h、1 h、2 h血糖值和HbA1c 均顯著高于對照組，年齡、產(chǎn)前BMI、孕次、產(chǎn)次、分娩方式、居住地、文化程度及職業(yè)等臨床資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組具有可比性。見表1。

表1 兩組研究對象臨床資料比較

2.2 兩組孕婦外周血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表達水平比較 由于在檢測過程中GDM 組有1 例樣本的每個指標均出現(xiàn)極大值，本研究經(jīng)核對孕婦基本資料與病史并未發(fā)現(xiàn)有特殊之處，故將該樣本數(shù)據(jù)予以剔除后進行分析。ELISA 結(jié)果顯示GDM 組EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表達水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而其余3個蛋白HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 在GDM 組和對照組血清中的表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果詳見圖1和表2。

表2 兩組孕婦血清EPPK1、CIRBP、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPL、RAB21、RAB3B 表達水平比較[M(IQR)]單位：pg/mL

圖1 兩組EPPK1、CIRBP、HNRNPAB、RAB3B、HNRNPA2B1、HNRNPL、RAB21 表達比較的箱式圖(A 為EPPK1；B 為CIRBP；C 為HNRNPAB；D 為RAB3B；E 為HNRNPA2B1；F 為HNRNPL；G 為RAB21)

2.3 GDM 發(fā)生影響因素的二元Logistic 回歸分析 以是否GDM 為因變量，EPPK1、CIRBP、RAB3B和HNRNPAB 表達水平為協(xié)變量進行二元Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示EPPK1 和RAB3B 高表達是GDM發(fā)生的影響因素。見表3。

表3 GDM 發(fā)生影響因素的二元Logistic 回歸分析

2.4 EPPK1 和RAB3B 對GDM 的檢驗效能分析 為評價EPPK1和RAB3B在GDM診斷中的價值，以EPPK1繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，截斷值為550.0 pg/mL，曲線下面積(AUC)為0.885，靈敏度為0.931，特異度為0.733，具有統(tǒng)計學意義；以RAB3B 繪制ROC 曲線，則截斷值為333.1 pg/mL，AUC 為0.779，靈敏度為0.966，特異度為0.633，具有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 EPPK1 和RAB3B 檢驗GDM 效能的ROC 曲線(A 為EPPK1;B 為RAB3B)

3 討論

GDM 是全球范圍內(nèi)日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，它增加了妊娠期高血壓、羊水過多、產(chǎn)后出血、巨大兒、產(chǎn)傷、新生兒低血糖的發(fā)生率和母兒遠期患2 型糖尿病、代謝綜合征及心血管疾病的風險[2-4]。研究表明，及時發(fā)現(xiàn)和治療GDM 能夠有效改善妊娠結(jié)局[11]。生物標志物在臨床上可以用來預測或診斷疾病，洞察疾病的病理生理過程，并可用于對治療干預的藥理學反應的監(jiān)測或臨床結(jié)局的預測[12]。因而，關于GDM 的早期篩查生物標志物的開發(fā)受到了廣泛關注。

目前，臨床上對于GDM 的診斷和治療過程的效果判斷均以監(jiān)測血糖為主，但現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)即使嚴格治療使血糖達到目標水平，GDM 病人胎盤的形態(tài)與功能依然會發(fā)生改變[13-14]，其母嬰并發(fā)癥的發(fā)生率仍高于正常孕婦[15]。故僅依靠血糖監(jiān)測不足以很好地達到預測和防治GDM 及其并發(fā)癥的目的。迄今為止，已報道的GDM 早期預測因子包括一些血糖標志物[16-18]、炎癥標志物[16]、胰島素抵抗標志物[19]、脂肪細胞衍生標志物[20]和胎盤衍生標志物[21-22]等，但這些指標存在諸多不足之處，如有的研究結(jié)果不一致、有的特異性或敏感性較差、有的沒有臨床可用的閾值、有的預測能力較低等，且大多數(shù)為小樣本病例對照研究，也沒有進行成本效益分析[23]。因此，目前臨床上尚缺乏方便、簡單、經(jīng)濟、特異性和敏感性高的早期篩查指標。

本研究ELISA 結(jié)果顯示，GDM 組血清EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 表達水平均高于對照組，與前期胎盤組織iTRAQ 和PRM 蛋白組學的研究結(jié)果一致，說明這4 個蛋白在GDM 中的表達呈現(xiàn)穩(wěn)定上調(diào)的趨勢，可能對GDM 的發(fā)生發(fā)展過程具有重要作用。Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，EPPK1 和RAB3B 高表達是GDM 發(fā)生的影響因素；進一步分別以EPPK1 和RAB3B 指標繪制ROC 曲線，當EPPK1 截斷值為550.0 pg/mL 時，其對GDM 檢驗效能的靈敏度為0.931，特異度為0.733，AUC 為0.885；當RAB3B 截斷值為333.1 pg/mL 時，RAB3B 對GDM 檢驗效能的靈敏度為0.966，特異度為0.633，AUC 為0.779。提示臨床上應該對血清EPPK1＞550.0 pg/mL 和RAB3B＞333.1 pg/mL 的孕婦實行嚴格的妊娠期血糖監(jiān)測，以及時發(fā)現(xiàn)血糖異常并進行干預。因此，前期iTRAQ、PRM 和本研究ELISA 多重組合檢測結(jié)果一致，結(jié)合ROC 曲線分析結(jié)果，本研究認為EPPK1 和RAB3B 可以作為GDM 的候選生物標志物。

因為理想的生物標志物應在生物體中穩(wěn)定表達、檢測的樣本容易獲得、對疾病狀態(tài)的相關變化敏感，能夠在臨床癥狀出現(xiàn)之前對疾病進行早期檢測，具有區(qū)分疾病病理的能力，并具有成本效益和重復性[24-25]。故本研究的重要意義主要在于篩選出了GDM 潛在的生物標志物，為新型生物標志物的開發(fā)提供了方向與思路。至于EPPK1 和RAB3B 能否成為具有臨床可用性的標志物，還需要對不同人群進行大樣本的前瞻性隊列研究。由于本研究是病例對照設計研究，僅收集妊娠晚期孕婦的血清進行蛋白表達水平檢測，未能明確和比較這些蛋白指標在發(fā)展為GDM 和未發(fā)展為GDM 的孕婦整個孕期的動態(tài)表達變化過程。因此，未來研究可采用縱向隊列研究，檢測與對比EPPK1、CIRBP、 HNRNPA2B1、 HNRNPAB、 HNRNPL、RAB21 和RAB3B 在GDM 和正常孕婦妊娠早、中、晚期血清中的表達情況，并進行ROC 曲線分析了解其對GDM 的預測能力及價值。相信隨著今后對相關實驗研究日益展開和臨床大樣本研究的驗證，能夠揭示這些蛋白在GDM 發(fā)病中的因果關系和具體作用途徑與機制，并有望成為該病的新型生物標志物，在GDM 的早期篩查、預防及早期的治療干預中具有重要價值。

4 小結(jié)

EPPK1、CIRBP、HNRNPAB 和RAB3B 在GDM孕婦血清中高表達，EPPK1 與RAB3B 對GDM 具有較好的診斷效力，可作為GDM 的候選生物標志物。但這些蛋白在GDM 中的具體作用和是否具有臨床應用價值，有待進一步研究。