花椒葉浸提液對(duì)紫云英種子的化感作用

王啟,何靜，張樹衡，丁德東，馬楠，郝琴，吳怡豪

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

紫云英(Astragalussinicus)為豆科(Leguminosae)良好的綠肥作物，其與根瘤菌共生固氮效率高，并在植株腐解時(shí)可有效提升土壤中的氮素含量，而且可以實(shí)現(xiàn)綠肥和牧草兼用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是建立可持續(xù)農(nóng)林復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)良作物之一?；ń?Zanthoxylumbungeanum)屬蕓香科(Rutaceae)植物，為多年生木本油料和香料樹種，是一種集調(diào)味、藥用為一體的經(jīng)濟(jì)樹種。甘肅省種植生產(chǎn)的蜀椒、秦椒和貢椒等自古至今均有名，主要分布在隴南、隴東地區(qū)[1-2]。目前，間作草本植物以建立多物種組成和多層次結(jié)構(gòu)配置的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、生態(tài)效益好的坡地花椒農(nóng)林復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)，已成為當(dāng)下農(nóng)林經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必然趨勢(shì)?；凶饔脤?duì)生態(tài)系統(tǒng)中植物群落的形成、演替和抗逆性以及作物間選擇最適的連、間、套作方式有重要的影響[3-4]。近年來，利用化感的促進(jìn)與抑制作用合理選擇間、輪、套作方式解決植物的連作障礙已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一[5-6]。

目前，已有報(bào)道指出，花椒葉浸提液對(duì)4種牧草草地早熟禾、高丹草、苜蓿和白三葉種子的萌發(fā)均有一定抑制作用，而對(duì)苜蓿和草地早熟禾莖、根生長(zhǎng)因濃度不同而表現(xiàn)為“低促高抑”[7]；也有研究表明，大豆生長(zhǎng)受到的抑制作用隨花椒葉浸提液濃度的升高而增強(qiáng)[8]。可見，花椒葉浸提液對(duì)部分牧草具有一定的化感作用，但對(duì)綠肥作物紫云英的化感效應(yīng)及其機(jī)理還鮮有報(bào)道。因此，本研究通過不同濃度的花椒葉浸提液處理紫云英種子及幼苗，探明其化感效應(yīng)，并通過對(duì)供試植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及相關(guān)防御酶系統(tǒng)的影響研究，揭示花椒化感作用機(jī)理，為花椒農(nóng)林復(fù)合經(jīng)營(yíng)及科學(xué)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試花椒鮮葉采自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)林教研實(shí)踐基地成年“大紅袍”，葉片采集完成后將其置于50 ℃烘箱內(nèi)風(fēng)干保存；供試紫云英種子購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所。

1.2 方法

1.2.1 花椒葉浸提液的制備 將風(fēng)干后的花椒葉片剪成大小均勻的碎片，分別取0、10、20、30、40 g干葉于1 000 mL燒杯中，加入900 mL蒸餾水，浸泡24 h后，加水至1.0 L，用3層紗布過濾即得到0、10、20、30、40 g/L的花椒浸提液原液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 采用培養(yǎng)皿濾紙法。選擇性狀優(yōu)良的紫云英種子，先與細(xì)沙混合攪拌摩擦5 min，再用 HgCl2(0.1%)消毒30 s，并用清水沖洗3～5次，用蒸餾水浸泡5 min。將消毒種子置于大小適當(dāng)并鋪設(shè)濾紙的培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿均勻撒放50粒紫云英種子。取等量上述不同濃度的浸提液，分別加入培養(yǎng)皿中，以加入等量的蒸餾水作為對(duì)照。然后放入人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置溫度為26 ℃，光照為16 h。根據(jù)培養(yǎng)皿中濾紙的損傷程度適時(shí)更換濾紙并及時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)濃度的浸提液。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理，每處理重復(fù)3皿。每天觀察并記錄胚根突破種皮的種子數(shù)，記錄結(jié)束后統(tǒng)計(jì)突破總數(shù)即為種子發(fā)芽總數(shù)，選取6株長(zhǎng)勢(shì)一致的紫云英幼苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)量幼苗根長(zhǎng)。發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)公式計(jì)算如下：

發(fā)芽率(%)=(胚根突破種皮的種子總數(shù)/供試的種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(胚根突破種皮最多日種子的數(shù)量/供試種子總數(shù))×100%；

1.2.3 相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定 可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法；脯氨酸含量的測(cè)定采用紫外吸收法；可溶性糖采用苯酚法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法；過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；過氧化氫酶(CAT)活性、超氧陰離子自由基(O2-)含量和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定均采用紫外吸收法。上述測(cè)定方法均參照文獻(xiàn)[9]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 化感效應(yīng)指數(shù)(RI)的計(jì)算與分析 化感效應(yīng)指數(shù)參照以下公式[10]進(jìn)行計(jì)算：

式中，C為對(duì)照值，T為處理值；RI>0代表促進(jìn)作用，RI<0代表抑制作用。

化感綜合效應(yīng)(SE)的計(jì)算：RI的絕對(duì)值表示化感作用強(qiáng)度，化感綜合效應(yīng)(SE)是指花椒浸提液的化感效應(yīng)指數(shù)的算術(shù)平均值[11]，SE絕對(duì)值的大小與化感作用強(qiáng)度一致。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，用SPSS 19.0軟件在P<0.05水平下進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒葉浸提液對(duì)紫云英種子萌發(fā)的影響

不同濃度花椒葉浸提液對(duì)紫云英種子萌發(fā)均呈抑制作用，表現(xiàn)為隨浸提液濃度增加，抑制作用越顯著(P<0.05)(圖1)，且其化感效應(yīng)指數(shù)(RI)越大，以40 g/L時(shí)花椒葉浸提液對(duì)供試紫云英種子的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)(表1)。

圖1 花椒葉浸提液處理下紫云英種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)

表1 不同濃度花椒葉浸提液對(duì)紫云英種子萌發(fā)的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)

2.2 花椒浸提液對(duì)紫云英種子幼苗根長(zhǎng)的影響

不同濃度花椒葉浸提液處理對(duì)紫云英幼苗根的生長(zhǎng)均表現(xiàn)為抑制作用，相較對(duì)照，處理根長(zhǎng)分別減少了31.2%、38.7%、66.3%、77.5%(圖2)。其中以處理濃度為40 g/L時(shí)化感效應(yīng)最強(qiáng)，對(duì)幼苗根長(zhǎng)抑制效果最為顯著(P<0.05)(表1)。

圖2 花椒葉浸提液處理下紫云英幼苗根長(zhǎng)

2.3 花椒葉浸提液對(duì)紫云英幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

隨浸提液濃度增加，紫云英幼苗體內(nèi)可溶性糖含量表現(xiàn)為先升后降(圖3-A)，在濃度為5 g/L時(shí)含量最高；可溶性蛋白和脯氨酸含量均隨浸提液濃度的增大呈逐漸升高的趨勢(shì)(圖3-A、圖3-B)。整體來看，隨浸提液濃度增加，紫云英幼苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量也呈增加趨勢(shì)(P<0.05)。

圖3 花椒葉浸提液處理下紫云英幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

2.4 花椒葉浸提液對(duì)紫云英幼苗防御系統(tǒng)酶活性的影響

不同浸提液處理下紫云英幼苗體內(nèi)SOD、CAT、PAL活性及MDA、O2-含量均發(fā)生明顯變化。具體表現(xiàn)為：隨著浸提液濃度的升高，CAT活性與O2-含量均呈先降后升趨勢(shì)(圖4-A、圖4-B)，其中，CAT活性在濃度為10 g/L時(shí)最低，O2-含量在濃度為20 g/L時(shí)最低。SOD活性隨浸提液濃度的增加呈顯著下降趨勢(shì)(圖4-C)，MDA含量則呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05)(圖4-D)，PAL活性先升高后降低(圖4-E)，在濃度為20 g/L時(shí)最高。表明高濃度的浸提液使紫云英幼苗體內(nèi)MDA、O2-含量大量積累，加劇了膜脂過氧化程度及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而抑制了相關(guān)防御酶的表達(dá)，進(jìn)一步影響了紫云英幼苗的生長(zhǎng)。

圖4 花椒葉浸提液對(duì)紫云英幼苗防御系酶活性的影響

3 討論

在生態(tài)系統(tǒng)中，化感物質(zhì)主要依靠雨水淋溶產(chǎn)生[12]。因此，本研究通過水浸法提取花椒葉片中的化感物質(zhì)。結(jié)果表明，浸提液濃度越大，其表現(xiàn)出的化感抑制作用越強(qiáng)，整體以濃度為40 g/L時(shí)抑制作用最為顯著。

植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)能在植株處于逆境時(shí)清除體內(nèi)活性氧，協(xié)同抵御外界脅迫。韓志軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，花椒葉浸提液對(duì)大豆種子MDA含量、SOD活性有顯著影響，陳錫等[13]的研究表明朝倉花椒葉水浸提取物通過破壞白菜幼苗體內(nèi)的酶系統(tǒng)而抑制其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，宋亮[14]的研究顯示花椒水浸液能影響苜蓿幼苗體內(nèi)的保護(hù)酶活性。本研究也得到類似結(jié)果。本試驗(yàn)中，隨著浸提液濃度的升高，紫云英幼苗體內(nèi)MDA含量逐步升高，導(dǎo)致O2-含量增高、SOD活性降低。Roshchina等[15]研究發(fā)現(xiàn)，化感物質(zhì)中的一些多酚類化合物會(huì)破壞細(xì)胞膜的功能，可能是受體植物的保護(hù)酶活性會(huì)受到化感物質(zhì)影響，導(dǎo)致活性氧增高，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)?？赏茰y(cè)花椒化感效應(yīng)的一種作用方式是破壞受體植株細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。趙紅等[16]在大蒜對(duì)大豆的化感作用的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。PAL活性的高低控制著植物體內(nèi)多種次生酚類化合物、類黃酮植保素等的產(chǎn)生，在植物的次生代謝中具有重要作用，而次生代謝是植物長(zhǎng)期演化過程中產(chǎn)生的防御機(jī)制[17-19]。本研究表明，隨著浸提液濃度的增大，紫云英幼苗的PAL活性先降低后升高，而CAT活性先降低后升高。這可能是由于高濃度的浸提液產(chǎn)生了較強(qiáng)的化感作用，從而破壞了植株次生代謝的防御機(jī)制。

滲透調(diào)節(jié)能力是植物適應(yīng)不良生長(zhǎng)環(huán)境，提高自身抗逆性的基石，植物可通過增大或減少自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來適應(yīng)環(huán)境變化[20]。可溶性糖和可溶性蛋白均為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植物應(yīng)對(duì)環(huán)境變化有著不可或缺的作用。Rochaix等[21]研究發(fā)現(xiàn)植物受鹽脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)被抑制，植物對(duì)糖的利用率下降，可溶性糖含量增加。同時(shí)段瑞軍等[22]研究鎘脅迫對(duì)海雀稗的影響發(fā)現(xiàn)，在受鎘脅迫時(shí)，其體內(nèi)可溶性糖含量增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著化感作用強(qiáng)度的提升，幼苗體內(nèi)可溶性糖含量先升高后降低，這可能是由試驗(yàn)材料的不同或處理方法間的差異所致。植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多是參與各種酶的代謝及保護(hù)細(xì)胞生物膜的合成，遭遇逆境時(shí)其含量會(huì)發(fā)生變化。因此，可通過測(cè)定可溶性蛋白含量變化，在一定程度上反映植物抗逆性[23]。李妮亞等[24]認(rèn)為，多種逆境脅迫作用會(huì)抑制植物正常蛋白質(zhì)的合成途徑而減少其在植物體內(nèi)的含量，同時(shí)有一些植物會(huì)被誘導(dǎo)出新的蛋白質(zhì)或增加原有蛋白質(zhì)的含量來增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)力。植物在遭受低溫脅迫時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)分泌大量的可溶性蛋白[25-26]，在遭受干旱脅迫時(shí)，其體內(nèi)的可溶性蛋白含量變化明顯[27]。杜世章等人發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下脯氨酸的積累是植物抵御外界脅迫的有效方式[28]。本研究結(jié)果表明，隨化感強(qiáng)度的提升，紫云英幼苗體內(nèi)可溶性蛋白、Pro含量越多，表明紫云英可以通過分泌可溶性蛋白和Pro來抵御體內(nèi)遭受的傷害。

4 結(jié)論

本研究顯示，花椒葉浸提液對(duì)紫云英種子萌發(fā)及根長(zhǎng)均具有一定抑制作用，且隨濃度的增大抑制作用越顯著；同時(shí)，通過探究其對(duì)紫云英幼苗生理生化指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，隨著浸提液濃度的增加，紫云英幼苗體內(nèi)防御系統(tǒng)相關(guān)酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化明顯。由此可知，花椒葉浸提液主要通過抑制紫云英體內(nèi)的防御酶活性，并對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成傷害而發(fā)揮其化感效應(yīng)。此外，由于花椒樹體多個(gè)部位均能產(chǎn)生化感物質(zhì)，而本試驗(yàn)僅研究了葉浸提液對(duì)紫云英的化感作用，且并未對(duì)花椒葉浸提液做成分分析，因此還有待在今后的研究中進(jìn)一步探明。