昆明小鼠高血脂癥模型的建立

吳志煥，曹丹丹，周 瑾

生命科學(xué)與技術(shù)

昆明小鼠高血脂癥模型的建立

吳志煥1，曹丹丹2，周 瑾2

（1. 河北工程技術(shù)學(xué)院 人工智能與大數(shù)據(jù)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2. 河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017）

將20只昆明小鼠隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組，分別給予高脂飼料和普通飼料飼喂，進(jìn)行4周和6周兩次造模。比較4周和6周造模相關(guān)指標(biāo)的差異發(fā)現(xiàn)，模型組體重和肝重均比對(duì)照組顯著增加，模型組動(dòng)物血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）均顯著高于對(duì)照組，但高密度脂蛋白（HDL-C）濃度差異不顯著。造模4周和6周的小鼠肝組織均出現(xiàn)不同程度的病理改變，造模時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使血脂變化更加顯著。利用高脂飼料飼喂法獲得的小鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)數(shù)，建立了穩(wěn)定的小鼠高脂血癥模型，為開展降血脂藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

昆明小鼠；高血脂癥；高脂血癥小鼠模型；造模時(shí)間

科技的飛速發(fā)展改變了人民的生活方式，很多人養(yǎng)成了飲食過量、長(zhǎng)期過多飲食油膩食品、運(yùn)動(dòng)不足等不良習(xí)慣。這些不良習(xí)慣是引發(fā)許多慢性病如高血脂、高血壓、高血糖等“文明病”的重要原因[1]。目前，這種“文明病”發(fā)病率急劇增高，并且發(fā)病特征呈年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅了人類健康，增加了社會(huì)負(fù)擔(dān)[2]。因此，研究如何控制高血脂對(duì)預(yù)防現(xiàn)代“文明病”具有積極的意義。高血脂癥動(dòng)物模型是研究預(yù)防現(xiàn)代“文明病”的基礎(chǔ)條件。通過建立高血脂癥動(dòng)物模型，尋找高效且不良反應(yīng)少的降血脂藥，已成為國(guó)內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。

目前，此類模型的動(dòng)物主要有鼠類、兔、豬等動(dòng)物，其中鼠類是最常用的動(dòng)物模型[3-4]。昆明小鼠作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的常用動(dòng)物，具有操作簡(jiǎn)便、飼養(yǎng)方便、生長(zhǎng)發(fā)育較快、代謝旺盛等優(yōu)點(diǎn)。為了更好地研究動(dòng)物群體對(duì)脂類代謝的特點(diǎn)，本研究選用雌雄各半的昆明小鼠，喂養(yǎng)高脂飼料，建立小鼠的高血脂模型。通過體重增長(zhǎng)情況、血清血脂指標(biāo)和肝臟形態(tài)及肝臟組織細(xì)胞學(xué)變化等指標(biāo)驗(yàn)證高脂模型的正確性[5-6]，為降血脂藥物的開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取體重均為20 g左右的昆明小鼠雌雄各20只（購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2018-004），常規(guī)飼養(yǎng)一周。

1.1.2 試劑

血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于Beckman Coulter，Inc。試劑公司。糖化血清蛋白（GSP）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司。其他檢測(cè)試劑均為分析純。

基礎(chǔ)飼料組成為23.07%的蛋白質(zhì)、11.85%的脂肪、65.08%的碳水化合物。高脂飼料組成為基礎(chǔ)飼料配以15%豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇和0.2%膽酸鈉，購(gòu)置于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理

選取40只體重約20 g的昆明小鼠，適應(yīng)性飼喂1周以后，隨機(jī)均分為對(duì)照組和模型組（雌雄各半）。對(duì)照組為飼喂基礎(chǔ)飼料，模型組飼喂高脂飼料，兩組均為自由飲食，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天為第0 d。

1.2.2 體重測(cè)量

第一次造模于第0、1、2、3、4周，稱量體重；第二次造模于第0、1、2、3、4、5、6周，統(tǒng)計(jì)各組小鼠體重的增重情況，計(jì)算增重率[7]。

增重率（%）=（終末平均體重-初始平均體重）/初始平均體重*100%。

1.2.3 血清生化檢測(cè)

分別于4周后及6周后進(jìn)行眼眶采血，血樣經(jīng)3 000 r/min離心15 min，取上層血清[8]，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定GLU、GSP、TC、TG、LDL、HDL等濃度。

1.2.4 肝組織病理檢測(cè)

兩次造模分別于4周后及6周后經(jīng)頸椎脫臼法處死小鼠，然后迅速分離肝組織，稱重。采集的部分肝組織經(jīng)4%多聚甲醛組織固定液進(jìn)行固定后制作病理切片，HE染色后，在顯微鏡下觀察病理變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)均由統(tǒng)計(jì)學(xué)SPASS20軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重指標(biāo)的測(cè)定

在第1次造模過程（圖1a）中發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠體重均增加，從第1周開始，模型組的體重就顯著高于對(duì)照組，且模型組的增加速度顯著高于對(duì)照組；第2次造模（圖1b）與第一次趨勢(shì)相同，到第六周的時(shí)候，模型組增加速度比對(duì)照組快20-30%。

2.2 肝重及肝臟組織病理檢查

兩次造模結(jié)束后，模型組肝重分別是對(duì)照組肝重的1.24倍和1.31倍，均具有顯著性差異（＜0.01），詳見表1和表2。

表1 第一次造模（4周）昆明小鼠肝重結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

表2 第二次造模（6周）昆明小鼠肝重結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

觀察肝臟組織形態(tài)（見圖2）發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組肝臟呈紅褐色，質(zhì)地柔而脆，模型組肝臟顏色泛黃，質(zhì)地韌而略顯飽滿；通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞整齊排列，未見明顯形態(tài)學(xué)變化；模型組肝臟組織的結(jié)構(gòu)明顯病變，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞內(nèi)具有大小不等的圓形空泡（脂肪滴）。中央靜脈和小葉間靜脈還出現(xiàn)了少量紅細(xì)胞。

A：對(duì)照組正常肝臟；B：對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)；C：對(duì)照組肝細(xì)胞；D：造模4周肝臟；E：造模4周肝組織結(jié)構(gòu)；F：造模4周肝細(xì)胞

2.3 小鼠血脂水平的檢測(cè)

造模4周后血清經(jīng)生化分析測(cè)得的模型組血清TC、TG、LDL-C分別為對(duì)照組均值的1.81倍、1.40倍和1.45倍，均具有極顯著差異（<0.01），但HDL-C的濃度檢測(cè)模型組與對(duì)照組分別為0.717 mmol/L和0.67 mmol/L，差異不顯著（>0.05），詳見表3。造模6周與造模4周模型組與對(duì)照組的比較存在類似的規(guī)律，詳見表4。比較兩次造模結(jié)果可知，對(duì)照組之間TC、TG、HDL-C、LDC-C值差異不顯著（>0.05）；模型組之間TG差異不顯著（>0.05）；造模6周模型組TC、HDL-C、LDC-C均值為造模4周模型組均值的118.2%、87.3%、114%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01）。

表3 第一次造模（4周）昆明小鼠血清血脂相關(guān)指標(biāo)

表4 第二次造模（6周）昆明小鼠血清血脂相關(guān)指標(biāo)

3 討論

建立良好的高血脂模型對(duì)高血脂癥以及降血脂藥物的研究具有重要的意義。目前，常用的有基因缺陷型方法、以大鼠、小鼠、兔等動(dòng)物為研究對(duì)象，注射或者高脂飼料飼喂，建立高脂模型的方法[9-10]?；蛉毕菪头椒ㄔ靸r(jià)較高，注射方法繁瑣使動(dòng)物較難長(zhǎng)時(shí)間耐受，所以本研究選擇操作簡(jiǎn)單的高脂飼料飼喂方法，并選取代謝水平較高，生長(zhǎng)發(fā)育較快、易操作的昆明小鼠作為研究對(duì)象。

高脂模型的建立受飼喂時(shí)間的影響較大，2015年，天津中醫(yī)藥大學(xué)周昆教授課題組為了縮短模型建立時(shí)間，提出并驗(yàn)證了P407誘導(dǎo)法[11]。本研究比較4周和6周造模時(shí)間對(duì)模型建立的影響，探討高脂飼料飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)高血脂模型指標(biāo)的影響，也是旨在尋找短時(shí)間建立穩(wěn)定高脂模型的途徑。

兩次造模中，昆明小鼠均能很好地耐受高脂飲食，實(shí)驗(yàn)過程中沒有拒食、拒飲等現(xiàn)象的出現(xiàn)。從飼喂第1周開始，模型組與對(duì)照組體重就出現(xiàn)明顯差異，其體重增長(zhǎng)速度也明顯快于對(duì)照組，說明小鼠對(duì)高脂飼料的代謝與吸收具有良好的效果。兩次造模結(jié)束后，造模時(shí)間4周和6周的模型組平均體重比相應(yīng)的對(duì)照組分別重5.15 g和5.57 g，增重率分別為對(duì)照組的1.79倍和1.71倍，這符合高血脂癥體重增加的特點(diǎn)，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），說明小鼠對(duì)該高脂飼料配方的代謝良好。

肝重以及肝組織的病理檢測(cè)結(jié)果顯示，造模4周與造模6周模型組的肝重均顯著高于對(duì)照組（＜0.01），造模6周肝重為造模4周肝重的1.22倍，說明隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟病理變化較大，所得結(jié)果與2021年湖南省職業(yè)病防治院蔡拓等人的研究結(jié)果一致[12]。觀察造模4周的肝組織發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組顏色泛黃，顯微觀察發(fā)現(xiàn)模型組肝組織的肝小葉結(jié)構(gòu)消失，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，對(duì)照組肝索清晰，肝細(xì)胞排列整齊，充分表明模型組肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了病變，證明高脂飼料飼喂法可使小鼠發(fā)生急性肝損傷，從而導(dǎo)致脂代謝紊亂。

小鼠血清血脂的檢測(cè)結(jié)果表明，模型組血清TC、TG和LDL-C血脂指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組（＜0.01），模型組HDL-C水平與對(duì)照組相當(dāng)，沒有顯著差異（＞0.05），造模時(shí)間延長(zhǎng)，TC、TG和LDL-C水平均增高，而HDL-C均值下降，且兩次造模模型組之間TC、HDL-C、LDC-C均值均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說明，兩次造模均成功建立了昆明小鼠高血脂癥模型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，6周造模中血脂指標(biāo)更加完善，指標(biāo)變化規(guī)律與人類長(zhǎng)時(shí)間食用高脂食品導(dǎo)致血脂增高的規(guī)律一致，因而6周造模實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)規(guī)律對(duì)研究降血脂藥物更有參考價(jià)值。

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Establishment of Hyperlipidemia Model in Kunming Mice

WU Zhi-huan1, CAO Dan-dan2, ZHOU Jin2

(1. School of Artificial Intelligence and Big Data, Hebei Polytechnic Institute, Shijiazhuang 050091, China; 2. School of Public Health, Hebei Medical Universty, Shijiazhuang 050017, China)

Kunming mice were fed with high-fat diet to obtain hyperlipidemia animal model. Each assay, 20 Kunming mice were randomly divided into model group and control group. They were fed with high-fat diet and normal diet respectively. The model was established twice for 4 weeks and 6 weeks. After modeling, the animal biochemical indexes were measured to establish a stable animal model of hyperlipidemia in Kunming mice. The differences of related indexes between 4 weeks and 6 weeks were compared. The serum total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein levels in the model group were significantly higher than those in the control group, but there was no significant difference in the concentration of high-density lipoprotein. The liver tissues of the mice at 4 and 6 weeks of modeling showed different degrees of pathological changes, and prolonged modeling time will make blood lipid changes more significant. In conclusion, the experiment successfully established a stable hyperlipidemia mouse model by feeding with high-fat diet, which laid a foundation for further research on hypolipidemic drugs.

Kunming mice; hyperlipidemia; animal model; establishment

Q955

A

1009-9115(2021)06-0037-04

10.3969/j.issn.1009-9115.2021.06.010

河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目

2021-04-06

2021-09-07

吳志煥（1982-），女，河北衡水人，碩士，講師，研究方向?yàn)樯?、藥理學(xué)。

（責(zé)任編輯、校對(duì)：范永山）