芪冬活血飲中藥湯劑UPLC指紋圖譜研究

趙海茵 駱紅飛 王華剛 吳美蘭

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005

2 浙江景岳堂藥業(yè)有限公司 浙江 紹興 312025

芪冬活血飲由黃芪、麥冬、虎杖及當(dāng)歸四味中藥組成，其復(fù)方符合清熱解毒、祛瘀通腑、益氣養(yǎng)陰的治療原則。通過(guò)長(zhǎng)期臨床研究與實(shí)踐，證實(shí)其對(duì)急性肺損傷患者有良好的治療效果[1，2]。目前芪冬活血飲主要以中藥湯劑的形式用于臨床治療，其煎煮過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且口服劑量大，久置易發(fā)霉變質(zhì)，攜帶與儲(chǔ)存不便，很難適應(yīng)現(xiàn)代化生活的需要。研究表明，將中藥材經(jīng)過(guò)提取、濃縮、干燥、制粒包裝制成顆粒劑，可以極大地提高中藥的安全、方便和有效性。同時(shí)建立以湯劑為基準(zhǔn)的指紋圖譜，可以很好地保證顆粒劑與湯劑質(zhì)量的一致性[3-6]。本課題收集黃芪、麥冬、虎杖及當(dāng)歸飲片各10批，制成芪冬活血飲中藥湯劑進(jìn)行指紋圖譜研究，為芪冬活血飲顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：賽默飛vanquish UPLC（HPG-3400）；電子天平［BT-125D，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；煎藥壺30B2（康雅順電器有限公司）。

1.2 對(duì)照品：虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-201603，純度87.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201907，純度96.8%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201614，純度99.0%），對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 試劑：甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

1.4 飲片：?jiǎn)挝讹嬈魇占?0批，飲片信息見(jiàn)表1。飲片均由浙江景岳堂藥業(yè)有限公司提供。

表1 飲片信息表

2 試驗(yàn)方法

2.1 芪冬活血飲中藥湯劑的制備：依照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)文），取黃芪、虎杖各20g，當(dāng)歸、麥冬各12g，第一次加水576ml，浸泡30分鐘，煎煮30分鐘，過(guò)濾藥液；第二次加水448ml，煎煮20分鐘，過(guò)濾藥液。合并兩次濾液，作為中藥湯劑樣品，共制成10批中藥湯劑樣品，制備信息見(jiàn)表2。

表2 中藥湯劑制備信息表

2.2 指紋圖譜方法：分述如下。

2.2.1 色譜條件：色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18-AQ(2.1mm×100mm，1.9μm）；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸為流動(dòng)相B，按以下梯度進(jìn)行洗脫，具體見(jiàn)表3。檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速0.2ml/min，柱溫30℃。

表3 色譜條件

2.2.2 對(duì)照品溶液制備：取虎杖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成15μg/ml的溶液；取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成50μg/ml的溶液；取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成12μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備：取中藥湯劑樣品，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察：取ZYTJ-001樣品進(jìn)行特征圖譜方法學(xué)考察，分述如下。

2.3.1 專(zhuān)屬性：精密吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液各1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。色譜圖見(jiàn)圖1。供試品溶液中共分離出9個(gè)特征峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，其中3個(gè)峰分別與阿魏酸、虎杖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品峰的保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 指紋圖譜結(jié)果表

2.3.2 精密度：精密吸取供試品溶液1μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜2%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性：取供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12小時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD＜2%，表明供試品溶液12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性：依照“2.2.3”項(xiàng)下供試品處理方法制備6份供試品溶液，精密吸取1μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。與虎杖苷對(duì)應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD＜2%，表明此方法重復(fù)性良好。

3 指紋圖譜建立

依法處理10批中藥湯劑樣品，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0版，以10批中藥湯劑樣品的超高效液相色譜（UPLC）圖進(jìn)行自動(dòng)匹配，建立對(duì)照品指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖2。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。從相似度結(jié)果可知，不同批次間芪冬活血飲中藥湯劑的指紋圖譜相似度均大于0.90%，相似度較高。

表5 指紋圖譜相似度結(jié)果

4 色譜峰歸屬

取ZYTJ-001中藥湯劑對(duì)應(yīng)的當(dāng)歸、虎杖和黃芪飲片，依照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)文）煎煮，制成中藥湯劑樣品，同法進(jìn)樣，記錄色譜圖，與ZYTJ-001中藥湯劑樣品進(jìn)行比較，確認(rèn)色譜峰歸屬。詳見(jiàn)圖3。經(jīng)色譜圖比對(duì)，峰1和峰2屬于當(dāng)歸與黃芪，峰3、峰5和峰9屬于黃芪，峰4和峰7屬于當(dāng)歸，峰6和峰8屬于虎杖。

5 討論

通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸）的比較，選擇乙腈-0.1%甲酸按梯度進(jìn)行洗脫，分離效果最佳。在柱溫25℃、30℃、35℃條件下洗脫，35℃條件下峰1與峰2分離效果較差，柱溫25℃條件下虎杖苷峰峰形較差，30℃條件下各峰的分離效果優(yōu)于其他柱溫。流速0.2ml/min條件色譜峰分離效果明顯優(yōu)于流速0.3ml/min與0.4ml/min。通過(guò)3D光譜圖分析，在254nm波長(zhǎng)下能較好的分離出更多的色譜峰。

建立合適的指紋圖譜可以較好地體現(xiàn)中藥湯劑的總體質(zhì)量及有效成分的傳遞關(guān)系，為中藥湯劑的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)。該方法通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，證明方法可行，并對(duì)10批樣品相似度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

該方法對(duì)芪冬活血飲湯劑中當(dāng)歸、虎杖和黃芪進(jìn)行了色譜峰歸屬。麥冬中有效成分有甾體皂苷、高異黃酮及多糖等[7]，在此色譜圖中未得到體現(xiàn)，還需采取其他方法進(jìn)行研究。