感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶蛹的差異表達(dá)蛋白篩選

徐 欣 劉中文 周其明 張永君 張耀亭 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南鄭州 450008)

柞蠶微孢子蟲引發(fā)柞蠶微粒子病，是重要的病害檢疫對象。蛋白質(zhì)組學(xué)是一個大規(guī)模、高通量地研究全套蛋白質(zhì)的學(xué)科，而質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為挖掘有價(jià)值的蛋白提供了一個更便捷的方法，成為重要的差異蛋白篩選技術(shù)。這一技術(shù)也被應(yīng)用在柞蠶微孢子蟲免疫反應(yīng)研究之中，研究者們基于其水平傳播過程始于柞蠶中腸[1]，得到了柞蠶中腸的差異基因和差異蛋白[2]，后續(xù)研究中也發(fā)現(xiàn)了感染后表達(dá)量顯著上調(diào)的差異表達(dá)基因[3]。但是，關(guān)于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶蛹的一些與免疫相關(guān)的蛋白種類與差異表達(dá)情況尚未見報(bào)道。柞蠶蛹是柞蠶羽化前的重要發(fā)育階段，蛹體內(nèi)劇烈地進(jìn)行著組織溶解和組織發(fā)生兩個過程，其中有可能還參與柞蠶微孢子蟲的垂直傳播過程。本試驗(yàn)運(yùn)用質(zhì)譜手段檢測柞蠶蛹侵染前后蛋白質(zhì)組成，并通過譜圖計(jì)數(shù)法比較不同樣品中的蛋白質(zhì)差異，以期篩選到在垂直傳播的關(guān)鍵時期與柞蠶免疫相關(guān)的蛋白，為蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試柞蠶品種

供試材料為一化性柞蠶品種“豫大一號”的蠶蛹，由河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院柞蠶育種研究室提供。同一批柞蠶蛹，經(jīng)過鏡檢后取出柞蠶微孢子蟲感染蛹10個(雌雄各5個)，正常蛹10個(雌雄各5個)，將柞蠶蛹用無菌水清洗后，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 柞蠶蛹組織蛋白提取

每個柞蠶蛹剪取部分腹部組織，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加兩顆5 mm磁珠，加適量有SDSL3、終濃度含EDTA的1×Cocktail，置于冰上5 min，加入終濃度10 mmol/L DTT；加入Tissue lyser后4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清；加終濃度為10 mmol/L的DTT，56 ℃中水浴1 h；加入終濃度55 mmol/L的IAM，暗室放置45 min；加5倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃放置2 h，4 ℃12 000 r/min離心15 min后棄上清；風(fēng)干沉淀，加入適量SDSL3，利用Tissue lyser 促進(jìn)蛋白溶解；4 ℃12 000 r/min離心15 min后取上清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。此部分試?yàn)所用試劑購于Sigma公司。

1.3 柞蠶蛹蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE檢測

制備12%分離膠和5%濃縮膠，加入含有β-巰基乙醇的上樣液，每孔10 μL上樣樣品。用考馬斯亮藍(lán)R250染色，再用脫色液(含30%甲醇，10%乙酸)脫色后采用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)照相。此部分試驗(yàn)所用試劑購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 質(zhì)譜檢測

使用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜TripleTOF5600+LC/MS/MS系統(tǒng)(AB SCIEX公司)進(jìn)行分析，樣品通過微升流速的液相Eksigent microLC 415系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段樣品經(jīng)過上樣緩沖液溶解，由自動進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱(5 μm,300 A,300μm×5mm)，接著被洗脫至分析柱(3 μm, 120 A, 300μm×15mm)進(jìn)行分離。利用兩個流動相(流動相A:3% DMSO,0.1% formic acid,97% H2O；流動相B:3% DMSO,0.1% formic acid,97% ACN)建立分析梯度。液相的流速設(shè)置為5 μL/min。質(zhì)譜DDA模式分析時，每個掃描循環(huán)中包含一個MS全掃描(scan range 350-1 500 m/z,ion accumulation time 250 ms)，以及隨后的40個MS/MS掃描(scan range 100-1 500 m/z,ion accumulation time 50 ms)。信號超過120 cps的肽段離子(+2～+5)觸發(fā)MS/MS掃描。MS/MS重復(fù)采集的排除時間設(shè)置為18 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析

TripleTOF5600+LC/MS/MS系統(tǒng)產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過ProteinPilot(V4.5)進(jìn)行檢索，采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是Paragon。檢索使用的數(shù)據(jù)庫是UniProt中Saturniidae的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)如下：Sample Type選Identification；Cys Alkylation選Iodoacetamide；Digestion選Trypsin；Search Effort設(shè)置為Rapid ID。檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白，余下的鑒定信息用作后續(xù)分析。

基于各蛋白譜圖數(shù)，我們將篩選不同樣品中差異顯著的蛋白。綜合不同樣品中各蛋白定量差異及豐度，設(shè)置差異蛋白篩選邊界線y=c/(x-xo)。

1.6 功能注釋

運(yùn)用NCBI blastp程序，從nr庫中檢索與提交蛋白序列相似的蛋白，進(jìn)行功能注釋。再從GO或KEGG數(shù)據(jù)庫中得到提交蛋白序列對應(yīng)的GO term和KEGG通路信息。得到質(zhì)譜鑒定到的所有蛋白的注釋信息后，提取其中差異表達(dá)蛋白的相關(guān)信息，統(tǒng)計(jì)類別和數(shù)目，通過超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行功能富集分析，即可篩選出與該試驗(yàn)相關(guān)的顯著功能類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染柞蠶微孢子蟲前后柞蠶蛹SDS-PAGE電泳圖譜

如圖1所示，二者均能分辨出多條清晰蛋白質(zhì)電泳帶，分子質(zhì)量 16～115 kD 范圍內(nèi)，45 kD 附近均有高豐度表達(dá)蛋白。感染柞蠶微孢子蟲柞蠶蛹內(nèi)15 kD的蛋白質(zhì)比正常柞蠶蛹表達(dá)量高。

ZC-正常柞蠶蛹

2.2 質(zhì)量控制

統(tǒng)計(jì)所鑒定到肽段的質(zhì)量偏差。如圖2所示，橫坐標(biāo)表示各鑒定肽段質(zhì)量偏差，即質(zhì)譜檢測質(zhì)量與肽段理論質(zhì)量的偏差?？v坐標(biāo)為肽段總數(shù)目。各肽段質(zhì)量偏差分布位于±20(ppm)之間，表明各肽段質(zhì)量偏差小于百萬分之二十，質(zhì)譜檢測精度良好。

圖2 肽段質(zhì)量偏差分布

試驗(yàn)中所用儀器檢測質(zhì)荷比范圍為350～1350 m/z，肽段離子化后大部分電荷數(shù)為2或3，結(jié)果符合質(zhì)譜檢測標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 質(zhì)譜檢測結(jié)果

樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測，根據(jù)圖3和表1所示的鑒定結(jié)果中部分蛋白信息來看，感染蛹和正常蛹的鑒定蛋白質(zhì)種類相近，鑒定出的蛋白質(zhì)種類分別為25個和106個，且感染蛹鑒定出的25種蛋白質(zhì)在正常蛹中均能對應(yīng)。但相應(yīng)肽段數(shù)量差別較大，可能與感染柞蠶微孢子蟲后柞蠶蛹的氨基酸缺失(低酸血癥)[5]有關(guān)，后期需要對篩選出的差異蛋白進(jìn)行功能鑒定，再結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步分析。

圖3 樣品概覽圖

表1 蛋白鑒定部分結(jié)果展示

2.3 差異表達(dá)蛋白篩選

計(jì)算不同樣品組間各蛋白譜圖數(shù)比值(ratio)和譜圖數(shù)平均值(MeanSP)。如圖4所示，以log2ratio為橫坐標(biāo)，log2MeanSP為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。設(shè)置差異蛋白篩選邊界線，根據(jù)各蛋白散點(diǎn)分布標(biāo)注差異顯著性。

圖4 差異表達(dá)蛋白篩選散點(diǎn)圖

根據(jù)log2ratio以及l(fā)og2MeanSP篩選各組樣品間差異蛋白并標(biāo)注差異顯著性。感染蛹和正常蛹的差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)數(shù)量結(jié)果，篩選出顯著上調(diào)的蛋白1種，下調(diào)的蛋白3種，顯著下調(diào)的蛋白有37種，共篩選出41個差異蛋白，無差異蛋白67種。在篩選過程中，由于鑒定出的感染蛹蛋白質(zhì)種類較少，在進(jìn)行差異蛋白分析時，為了避免一些蛋白的表達(dá)量為0，無法處理的情況，采用在所有蛋白的表達(dá)量上加一個“背景表達(dá)量”，這個值設(shè)置為1，然后進(jìn)行l(wèi)og2(W/ZC)以及l(fā)og2MeanSP進(jìn)行篩選。部分差異表達(dá)蛋白結(jié)果見表2。

表2 部分差異表達(dá)蛋白列表

2.4 GO功能分析及富集結(jié)果

基因本體(Gene Ontology)是一個標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)化詞匯表，并以此從三個方面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性：參與的生物過程(BiologicalProcess)，分子功能(Molecular Function)和細(xì)胞組分(Cellular Component)。

對所篩選出來的41個差異蛋白進(jìn)行GO功能分析，聚類到最多的生物過程是：細(xì)胞過程(cellular process)、應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)、代謝過程(metabolic process)、多細(xì)胞生物過程(multicellular organismal process)、發(fā)展過程(developmental process)，見圖5(A)，所涉及的生物過程除了細(xì)胞基礎(chǔ)及代謝功能外，參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)種類較多，這部分蛋白與柞蠶蛹免疫柞蠶微孢子蟲的反應(yīng)關(guān)系密切。所處的細(xì)胞組分的聚類分析中包含以下4個：細(xì)胞解剖實(shí)體(cellular anatomical entity)、細(xì)胞內(nèi)(intracellular)、細(xì)胞(cell)、含蛋白質(zhì)復(fù)合物(protein-containing complex)，見圖5(B)，其中細(xì)胞解剖部分最多，占到42.37%。同時富集的分子功能中結(jié)合功能(binding)、催化活性(catalytic activity)、結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)這幾個方面的數(shù)量最多，見圖5(C)，這與柞蠶蛹在侵染后應(yīng)激反應(yīng)的一些酶類活性變化有關(guān)。

(A)

2.5 KEGG Pathway分析及富集結(jié)果

在對這些差異蛋白進(jìn)行KEGG分析后顯示，軍團(tuán)菌病(Legionellosis)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmicreticulum)、甲型流感(Influenza A)、雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)幾條通路與柞蠶蛹免疫柞蠶微孢子蟲相關(guān)，見圖6。圖6中Bar后的數(shù)字表示富集分析的P值，該圖展示KEGG富集結(jié)果的前15個條目。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工的KEGG信號通路圖如圖7所示，發(fā)現(xiàn)下調(diào)的蛋白有5個：蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(ERp57)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP94)、熱休克蛋白(Hsp70、Hsp90)、晶狀體蛋白(sHSF)。

圖6 KEGG注釋和富集分析

圖7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工的KEGG通路圖

3 討 論

柞蠶微孢子蟲的傳播途徑有兩種[6]，經(jīng)口傳染和胚種傳染。經(jīng)口傳染即水平傳播，有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)柞蠶中腸是柞蠶微孢子蟲水平傳播侵染的第 1 個組織也是重要組織[7]，在侵染后中腸相關(guān)酶活性下降，起到免疫作用[8]，還發(fā)現(xiàn)了幼蟲和蛹氨基酸缺乏癥[9]。本研究在建立柞蠶蛹侵染柞蠶微孢子蟲后的蛋白文庫時發(fā)現(xiàn)，侵染組的蛋白質(zhì)種類總量較正常組有較大降低，這一點(diǎn)符合前人研究結(jié)果，同時顯著下調(diào)的蛋白也已經(jīng)篩選出來37種，為下一步分析蛋白功能提供方向。

41個差異蛋白的GO功能分析中，發(fā)現(xiàn)聚類到最多的生物過程是細(xì)胞過程、應(yīng)激反應(yīng)、代謝過程；分子功能中結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性這3個方面的數(shù)量最多。所處的細(xì)胞組分的聚類分析中包含細(xì)胞解剖實(shí)體、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞、含蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中細(xì)胞解剖部分最多。這些蛋白與柞蠶蛹在侵染后應(yīng)激反應(yīng)的一些酶類活性變化有關(guān)，參與免疫微粒子病的相關(guān)反應(yīng)。同時KEGG 通路富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路中的EPR57、GRP94、Hsp70、Hsp90、sHSF這5種蛋白下調(diào)，初步預(yù)測為免疫蛋白，后期將進(jìn)行功能鑒定。