類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清14-3-3η蛋白水平及臨床檢測價值的初步研究

王偉遠，劉丹丹，張蓓，蔡悅，薄娜娜，雷潔，李會強

（1.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津 300203;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,天津 300193）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（R A）是臨床上常見的自身免疫性疾病，以雙側(cè)小關(guān)節(jié)慢性關(guān)節(jié)炎為特征，嚴重滑膜炎可損害關(guān)節(jié)功能及致殘[1]。類風(fēng)濕因子（RF）和抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（anti-CCP）是RA診斷和分型的傳統(tǒng)血清標志物，風(fēng)濕科醫(yī)生根據(jù)這些生物標志物，結(jié)合關(guān)節(jié)癥狀和放射學(xué)證據(jù)，可以診斷RA并評估疾病的發(fā)展進程。然而RA臨床表現(xiàn)多樣，部分早期癥狀不典型的患者和（或）血清學(xué)陰性的患者常被誤診、漏診[2-3]。因此，臨床迫切需要發(fā)現(xiàn)更有價值的生物學(xué)標志物，以提高目前RA的診斷和疾病監(jiān)測水平。有研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3蛋白是一組高度保守的蛋白家族，由7種亞型（β、γ、ε、η、σ、θ和ζ）組成。Kilani等[4]發(fā)現(xiàn)，炎性關(guān)節(jié)疾病患者的關(guān)節(jié)液和血清中14-3-3蛋白的η和γ2個亞型顯著增高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，血清14-3-3-η是一種新的特異性較高的RA生物標志物，其參與了RA相關(guān)炎癥介質(zhì)表達的上調(diào)和關(guān)節(jié)損傷機制[5]。本研究通過測定血清14-3-3η、RF、D-二聚體（D-Dimer）、紅細胞沉降率（ESR）、anti-CCP、CRP水平，分析評估血清14-3-3η水平對RA患者的診斷價值，并探討該生物標志物與其他實驗室指標以及臨床指標的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象研究對象均為2020年5月—12月天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院患者或健康體檢者。RA組136例，其中男28例，女108例，診斷符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）及2010年歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（EULAR）制定的RA分類標準，患者在確診前均未進行相關(guān)對癥藥物治療。疾病對照組65例，為非R A關(guān)節(jié)病變患者（系統(tǒng)性紅斑狼瘡18例，結(jié)締組織病17例，骨關(guān)節(jié)病22例，銀屑性關(guān)節(jié)炎4例，強直性脊柱炎4例），其中男12例，女53例。健康對照組36名，為體檢健康者，其中男22名，女14名。所有患者均符合相關(guān)指南診斷標準[2，6-7]，并經(jīng)風(fēng)濕免疫科醫(yī)生確認。所有標本均在患者知情同意條件下獲得，并獲得倫理委員會批準許可，審批號為TMUHMEC2017008。

1.2 相關(guān)實驗室指標檢測受試者于清晨采集空腹靜脈血分別置于真空采血管中，分離膠促凝血于3 500 r/min離心8 min，分離血清，離心半徑19 cm，用于14-3-3η、anti-CCP、CRP、RF的檢測。枸櫞酸鈉抗凝血于3 000 r/min離心15 min，離心半徑19 cm，分離血漿，用于檢測D-Dimer。枸櫞酸鈉抗凝全血用于ESR檢測。RF、CRP檢測所用儀器為西門子BNII蛋白分析儀及其配套試劑。采用光激化學(xué)發(fā)光法檢測14-3-3η蛋白，檢測儀器為LICA HT光激化學(xué)發(fā)光分析儀（試劑為國產(chǎn)光激化學(xué)發(fā)光試劑），采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測anti-CCP，檢測儀器為RAYTO RT-6100酶標分析儀（試劑為深圳亞輝龍試劑盒），根據(jù)試劑說明書，14-3-3η蛋白≥0.2 ng/mL為陽性，采用散射免疫比濁法檢測RF、CRP，檢測儀器為西門子BNII蛋白分析儀及其配套試劑。采用免疫比濁法檢測D-Dimer，檢測儀器為希森美康CX-5100凝血分析儀及其配套試劑，采用魏氏法（Westergren）檢測ESR，檢測儀器為亞輝龍VISON-C分析儀。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量變量用±s或中位數(shù)（P25，P75）表示，分類變量用頻數(shù)和百分比表示。兩組間比較采用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗。分析定量結(jié)果指標的相關(guān)性采用Spearman秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象臨床資料RA組平均年齡（56.2±12.7）歲。疾病對照組平均年齡（61.9±10.5）歲。健康對照組平均年齡（32.4±6.9）歲。各組間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有良好的可比性。

2.2 血清14-3-3η蛋白水平RA組血清14-3-3η蛋白水平為0.18（0.07，0.843）ng/mL，以cutoff≥0.2 ng/mL作為陽性區(qū)分標準，將RA組分為14-3-3η陰性組和14-3-3η陽性組，14-3-3η陽性組14-3-3η水平為0.86（0.45，2.31）ng/mL，14-3-3η陰性組為0.08（0.04，0.11）ng/mL（U=0.0，P＜0.000 1）。在疾病對照組中14-3-3η水平為0.07（0.05，0.09）ng/mL，在健康對照組中為0.02（0.02，0.03）ng/mL。RA組14-3-3η水平顯著高于疾病對照組和健康對照組（U=2 272.5、441.5，均P＜0.000 1）；同時在疾病對照組血清14-3-3η蛋白濃度也顯著高于健康對照組（U=237，P＜0.000 1），見圖1、2。

圖1 RA患者14-3-3η蛋白表達水平Fig 1 The expression of 14-3-3ηprotein in patients with RA

圖2 血清14-3-3η蛋白表達水平Fig 2 Expression of serum 14-3-3ηprotein

2.3 RA組14-3-3η水平與臨床指標相關(guān)性分析Spearman相關(guān)分析顯示，RA患者14-3-3η陽性組血清14-3-3η水平與RF、DAS28-CRP均呈正相關(guān)（均P＜0.05），與ESR、D-Dimer均呈負相關(guān)（均P＜0.05），與其他指標不相關(guān)，見表1。

表1 血清14-3-3η蛋白與各項臨床指標相關(guān)性分析Tab 1 Correlation between serum 14-3-3ηprotein and various clinical indicators

2.4 RA患者14-3-3η陽性組與陰性組相關(guān)指標表達差異分析RA患者14-3-3η陽性組RF與anti-CCP的表達均顯著高于14-3-3η陰性組（P=0.000、0.006），而其他指標沒有差異，見表2。

表2 14-3-3η陽性組與陰性組間各項臨床指標比較[±s，M(Q1，Q3)]Tab 2 Comparison of various clinical indicators between 14-3-3ηpositive group and negative group[±s，M(Q1，Q3)]

表2 14-3-3η陽性組與陰性組間各項臨床指標比較[±s，M(Q1，Q3)]Tab 2 Comparison of various clinical indicators between 14-3-3ηpositive group and negative group[±s，M(Q1，Q3)]

注：DAS28：28個關(guān)節(jié)疾病活動評分；TJC：壓痛關(guān)節(jié)數(shù)；SJC：腫脹關(guān)節(jié)數(shù)；CRP：C反應(yīng)蛋白；RF：類風(fēng)濕因子；ESR：紅細胞沉降率；anti-CCP：抗CCP抗體；D-Dimer：D二聚體

指標 14-3-3η陽性組（n=66） 14-3-3η陰性組（n=70） U P DAS28 6.06±1.18 5.82±1.17 1 957.5 0.205 DAS28-CRP 6.13（3.90，5.83） 5.17（4.34，5.84） 1 044.0 0.532病程（月） 96（57，147） 72（8，168） 1 973.5 0.180 Age（歲） 62.45±10.04 61.76±10.88 2 225.5 0.713 TJC（關(guān)節(jié)數(shù)） 13（5，18） 14（4，18） 2 194.5 0.614 SJC（關(guān)節(jié)數(shù)） 12（4，16） 12（3，16.5） 2 293.5 0.943 CRP（mg/L） 13.4（0.0，35.5） 8.1（0.01，41.8） 2 099.0 0.517 RF（IU/mL） 155.0（79.3，394.5） 12.9（0.0.82.7） 758.0 0.000 ESR（mm/h） 56.0（31.0，83.5） 43.0（21.5，77.5） 1 806.5 0.052 anti-CCP（U/mL） 149（55，429） 44（8，195） 528.0 0.006 D-Dimer（mg/L） 1.43（0.62，3.03） 0.88（0.46，1.93） 1 723.0 0.053

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)RA患者的血清中存在多種自身抗體[8-9]。雖然anti-CCP和RF已被廣泛用于RA的診斷，但已證實RF和anti-CCP陰性的RA患者約占RA患者總數(shù)的15%～25%[2，10]。且其在很多其他疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、脊柱關(guān)節(jié)病中也會出現(xiàn)，甚至在老年人中也有一定程度的升高，因此仍有部分患者診斷困難?；诖朔N現(xiàn)狀尋找RA相關(guān)指標，提高RA診斷的敏感性、特異性，實現(xiàn)早期診斷、早期治療成為臨床中亟待解決的問題，也是阻止RA病情發(fā)展和降低致殘率的關(guān)鍵。為此，筆者進一步探討了血清14-3-3η蛋白與其他生物指標對RA的臨床檢測價值。

14-3-3蛋白是一組高度保守的蛋白家族，由7種亞型（β、γ、ε、η、σ、θ和ζ）組成，在炎性關(guān)節(jié)疾病患者的關(guān)節(jié)液和血清中14-3-3蛋白的η和γ2個亞型增高顯著，以η亞型為主，且14-3-3η蛋白水平與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1和MMP-3顯著相關(guān)，說明14-3-3η很可能參與關(guān)節(jié)損傷機制[4]。Maksymowych等[5]使用與RA患者血清水平相當濃度的14-3-3η蛋白，發(fā)現(xiàn)其可激活關(guān)鍵細胞信號級聯(lián)反應(yīng)，促進促炎細胞因子和關(guān)節(jié)損傷因子的轉(zhuǎn)錄。Carrier等[11]報道盡管在基線水平接受了治療，14-3-3η蛋白水平升高的患者在未來5年內(nèi)仍然發(fā)展出嚴重的關(guān)節(jié)損傷，尤其是在老年患者中，提示14-3-3η水平升高為不良的預(yù)后標志。在接受重組人白細胞介素（IL）-6受體單克隆抗體（單抗）——托株單抗治療的RA患者中，14-3-3η的降低與疾病進展的緩解有關(guān)，因此可以作為監(jiān)測托株單抗療效的生物標志物[12]。此外，14-3-3-η還與RA患者骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)，可能是早期RA患者骨質(zhì)疏松的預(yù)測因子[13]。血清和關(guān)節(jié)滑液中14-3-3η蛋白與已確診類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的放射學(xué)損傷和疾病進展密切相關(guān)[14]。Tu等[15]報道血清14-3-3-η水平與中國RA患者疾病風(fēng)險、活動度和病程增加相關(guān)。檢測血清14-3-3η水平有助于多發(fā)性關(guān)節(jié)炎患者的早期診斷[11，16]。

本研究中，14-3-3η蛋白的臨界值采用試劑說明書參考為0.2 ng/mL。血清14-3-3η蛋白水平在部分RA患者中升高，在RA組與疾病對照組、RA組與健康對照組之間比較發(fā)現(xiàn)，14-3-3η蛋白在RA組中表達明顯高于健康對照組和疾病對照組，提示血清14-3-3η水平可能是預(yù)測RA風(fēng)險的良好指標，這與之前的文獻研究一致[4-5，17]，這可能與14-3-3η參與上調(diào)與RA炎癥進展密切相關(guān)的促炎細胞因子水平有關(guān)。而且Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，RA患者14-3-3η陽性組14-3-3η的表達水平與RF、DAS28-CRP呈正相關(guān)，提示14-3-3η可作為監(jiān)測RA患者病情活動性的一種新的生物標志物。血清14-3-3η蛋白與ESR、D-Dimer呈負相關(guān)，與CRP不相關(guān)，這與Tu等[15]研究不一致，可能的原因是RA患者14-3-3η表達水平與疾病活動性的相關(guān)性是可變的，如果存在關(guān)節(jié)病變相關(guān)組織損傷，14-3-3-η可能獨立于這些指標發(fā)揮作用。關(guān)節(jié)腔內(nèi)D-Dimer可促進單核細胞IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，與關(guān)節(jié)炎癥程度密切相關(guān)，早期檢測RA患者D-Dimer水平有利于預(yù)防高凝狀態(tài)。血清14-3-3η蛋白與D-Dimer呈負相關(guān)，考慮與患者入院前是否接受藥物治療有關(guān)，另外考慮住院患者一般病情較重，同時統(tǒng)計的樣本量不足也有可能造成一定的影響。本研究中，在RA患者14-3-3η陽性組中，RF與anti-CCP的表達水平也明顯高于陰性組，這種一致性可能是由于14-3-3η、RF和anti-CCP都參與了RA炎癥相關(guān)的IL-1β和IL-6的釋放過程[5]。如上所述，14-3-3η能夠誘導(dǎo)促炎性細胞因子的釋放，引起關(guān)節(jié)損傷，有可能增加RF的表達，從而增加RA的發(fā)病風(fēng)險。

綜上，本研究認為血清14-3-3η蛋白在部分RA患者中高檢測水平，與RA中RF、DAS28-CRP等多個實驗室指標密切相關(guān)，有希望成為預(yù)測RA風(fēng)險以及監(jiān)測RA進展的良好指標。本研究的不足之處在于樣本量較小，后續(xù)的研究還需要進一步擴大樣本量來評估14-3-3η蛋白對RA的風(fēng)險預(yù)測和診斷能力，以及它們與疾病進展和治療反應(yīng)的相關(guān)性。同時關(guān)于14-3-3η在RA中的具體作用機制也有待深入研究。此外，14-3-3η蛋白與多項指標（包括RF和anti-CCP）的聯(lián)合檢測將可能有助于早期發(fā)現(xiàn)RA。