利用CRISPR/Cas9技術(shù)體內(nèi)標記示蹤小鼠內(nèi)源性NPC1L1蛋白

武曉靜，陳玉霞，麻獻華，章衛(wèi)平，

（1.天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院，天津市內(nèi)分泌研究所，國家衛(wèi)健委激素與發(fā)育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134；2.海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，上海 200433）

膳食膽固醇的過量攝入是導致高膽固醇血癥的常見原因，對膽固醇吸收機制的認識可望為高膽固醇血癥的防治提供新的思路。目前認為，胞外游離膽固醇的吸收主要是由尼曼-匹克C1型樣蛋白1（Niemann-Pick C1-Like 1，NPC1L1）介導的囊泡內(nèi)吞（vesicular endocytosis）途徑實現(xiàn)的[1-3]。NPC1L1高表達于小腸吸收型上皮細胞的刷狀緣和人及靈長類動物的肝細胞膽管面[1，4]。NPC1L1基因敲除小鼠對膽固醇的吸收率下降約70%，能夠抵抗飲食誘導的高膽固醇血癥；而其他脂類（如甘油三酯、磷脂）和植物性甾醇的吸收則不受影響[1-2]。解析NPC1L1囊泡形成、內(nèi)吞、運輸和循環(huán)等相關(guān)過程的細胞分子機制，對揭示膽固醇的吸收機制具有重要意義。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過融合表達，在內(nèi)源性NPC1L1蛋白的C端分別標記上增強型綠色熒光蛋白EGFP和由DYKDDDDK 8個氨基酸組成的FLAG蛋白標簽，為該分子的示蹤和功能研究提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6N小鼠（品系代碼213）引自北京維通利華實驗動物公司。按照SPF級動物飼養(yǎng)標準繁殖飼養(yǎng)于本實驗室動物房[許可證號：SYXK（滬）2019-0034]，環(huán)境溫度25℃，濕度40%～70%，12 h光照，晝夜交替。小鼠飼料、墊料和飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理。8～10周齡的雄性小鼠用于實驗。

1.2 主要試劑載體質(zhì)粒pT7-2G、pCS-3G、pTV-4G來自Biocytogen Pharmaceuticals公司，限制性核酸內(nèi)切酶（Thermo Scientific Fast Digest系列），GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder（Thermo Scientific，SM1332），NeonTMTransfection System（Invitrogen，MPK 10096），2xTaq Plus Master MixⅡDye Plus（Vazyme，P213-01），KODFXDNA聚合酶（TOYOBO，KFX-101），MEGAshortscriptTMT7轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher Sci entific，AM1354），MEGAclearTM轉(zhuǎn)錄純化試劑盒（ThermoFisher Scientific，AM1908），DAPI（Invitrogen，D1306）。

1.3 sgRNA序列設計和活性檢測根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA切割原理，針對NPC1L1基因終止密碼子后的非翻譯區(qū)，在CRISPR設計網(wǎng)站（http：//www.sanger.ac.uk/htgt/wge/）上選擇打靶分數(shù)高且脫靶率低的sgRNA序列，3′端引入一個與靶向DNA序列錯配的堿基。sgRNA序列和對應的靶向序列見表1。于sgRNA序列兩側(cè)加上與pCS-3G骨架質(zhì)粒互補的同源臂序列，左側(cè)同源臂序列為5′-CTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′，右側(cè)同源臂序列為5′-GGTGTTTCGTCCTTTCCA-3′。合成單鏈寡聚核苷酸片段，經(jīng)退火后，通過Gibson無縫連接的方式連入經(jīng)Xho I和BamH I雙酶切線性化的pCS-3G質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后選擇經(jīng)測序驗證正確的克隆，采用UCATMCRISPR/Cas9熒光素酶活性檢測法檢測Cas9/sgRNA的活性。

表1 靶向NPC1L1基因3′UTR的sgRNA序列及其靶向DNA序列Tab 1 sgRNA and DNAsequences targeting 3′UTRof NPC1L1 gene

1.4 Cas9/sgRNA體外轉(zhuǎn)錄選擇高活性的sgRNA，在其對應的DNA序列兩側(cè)分別加上與骨架質(zhì)粒匹配的同源臂序列，其中5′端同源臂序列為5′-CTATTTCTAGCTCTAAAAC-3′，3′端同源臂序列為5′-TATAGTGAGTCGTATTA-3′。合成的兩條互補單鏈寡核苷酸片段經(jīng)退火后，通過Gibson無縫克隆方式組裝至經(jīng)Xho I和BamH I雙酶切的質(zhì)粒載體pT7-2G，質(zhì)粒經(jīng)測序正確后，使用T7 RNA聚合酶和MEGAshortscriptTMT7轉(zhuǎn)錄試劑盒，體外轉(zhuǎn)錄sgRNA和Cas9 mRNA，產(chǎn)物經(jīng)MEGAclearTM轉(zhuǎn)錄純化試劑盒純化回收后，進行RNA電泳檢測。

1.5 基因敲入打靶載體的構(gòu)建根據(jù)打靶方案，在NPC1L1基因3′UTR插入FLAG-EGFP基因序列。構(gòu)建打靶載體所用的引物見表2。以基因組DNA為模板，用引物LA-F/R PCR擴增5′端同源臂（LA），大小為1 388 bp；以基因組DNA為模板，用引物RA-F1/R的擴增產(chǎn)物為模板，再用引物RA-F2/R擴增得到3′端同源臂（RA），大小為1 294 bp；引物FG-F/R擴增插入的FLAG-EGFP基因序列（FG），長度為789 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)AIOTM法克隆進載體pTV-4G，經(jīng)酶切和DNA測序鑒定正確的克隆用于后續(xù)顯微注射。

表2 構(gòu)建打靶載體的引物序列Tab 2 Primer sequences for the construction of targeting vectors

1.6 小鼠受精卵顯微注射將體外轉(zhuǎn)錄制備的sgRNA、Cas9 mRNA和打靶載體質(zhì)粒配制成混合物，通過顯微注射法注射到C57BL/6N小鼠受精卵胞質(zhì)中，然后移植到假孕受體母鼠內(nèi)，母鼠生產(chǎn)獲得的子鼠稱為F0代小鼠。

1.7 小鼠基因型鑒定受精卵移植的假孕母鼠單籠飼養(yǎng)20 d后，觀察乳鼠出生情況。剪取長至1周后F0代小鼠尾尖組織1 cm，溶于500μL基因組DNA裂解液[0.2%SDS、0.2 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 g/L蛋白酶K]，提取基因組DNA進行PCR鑒定其基因型?；蛐丸b定引物設計見圖2A，反應體系為基因組DNA 1μL（50 ng），2×PCR mix12.5μL，10μmol/L上下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，總體積為25μL。采用Touchdown PCR，反應條件為94℃，2 min；98℃，10 s，67～57℃，30 s，68℃，2 min，每個循環(huán)降低0.7℃，共15個循環(huán)；98℃，10 s，57℃，30 s，68℃，2 min，共25個循環(huán)；再于68℃，10 min。反應結(jié)束后取10μL PCR產(chǎn)物跑2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物大小判斷小鼠基因型并經(jīng)測序確認。以P1F/P1R引物擴增得到2 154 bp產(chǎn)物且以P2F/P2R為引物擴增得到1 971 bp產(chǎn)物，為F0陽性小鼠。P1F序列為5′-ACTTCTCTGTAGATGGAACCCAG-3′，P1R序列為5′-GTAGTTG TACTCCAGCTTGTGCCCC-3′；P2F序列為5′-CACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3′，P2R序列為5′-CAGCCATAAGACCCATGCCAG-3′；P3F序列為5′-CAGGGCCAGATGTTAACCAAGC TCT-3′，P3R序列為5′-GTACCACTGCCACACG TTCCCAAG-3′。鑒定陽性的F0代小鼠和野生型C57BL/6N小鼠交配，獲得F1代小鼠。F1代小鼠基因型鑒定方法同F(xiàn)0代小鼠，經(jīng)鑒定有同源重組者再經(jīng)Southern印跡檢測確認。

1.8 可視化觀察NPC1L1-FLAG-EGFP蛋白的分布野生型和純合小鼠腹腔注射4%水合氯醛溶液麻醉后快速取小腸組織，剪取1 cm空腸中段組織，浸泡入4%的中性多聚甲醛中于4℃固定過夜。組織經(jīng)PBS洗滌后，依次在15%、30%的蔗糖溶液中脫水過夜，OCT包埋并經(jīng)液氮速凍后切片。厚度為8μm的冰凍切片于55℃烘烤20 min，10μg/mL DAPI溶液襯染5 min，PBS輕洗3 min×3次，晾干后中性樹膠封片，于倒置熒光顯微鏡（Olympus DP80）下觀察。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA靶向活性的檢測和制備針對NPC1L1基因第19外顯子靶向位點附近的不同區(qū)域，定制8條sgRNA的相應寡核苷酸鏈，構(gòu)建重組載體pCSsgRNA，并與包含靶點基因片段的pUCA-NPC1L1載體共轉(zhuǎn)染檢測Cas9/sgRNA的剪切活性。如圖1A所示，sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5、sgRNA8均有較強的剪切向?qū)Щ钚浴＞C合考慮靶點位置和活性結(jié)果，選擇sgRNA1進行體外轉(zhuǎn)錄制備向?qū)NA，凝膠電泳顯示sgRNA1在65℃溫育5 min呈現(xiàn)出單一條帶，提示成功制備可用于顯微注射的RNA（圖1B）。

圖1 靶向NPC1L1基因3′端sgRNA的活性檢測和轉(zhuǎn)錄Fig 1 The activity and transcription products of the sgRNA targeting 3′end of NPC1L1 gene

2.2 打靶載體的構(gòu)建和鑒定在小鼠NPC1L1基因的終止密碼子前面敲入FLAG-EGFP編碼序列的打靶策略見圖2A。打靶載體酶切鑒定結(jié)果如圖2B所示，正確的克隆經(jīng)Apa I酶切可得到6 076 bp和8 00 bp片段；經(jīng)HindⅢ和Sph I雙酶切可得到3 842 bp、2 025 bp和1 009 bp片段；經(jīng)Eco47Ⅲ和KpnⅠ雙酶切可得到4 611 bp和2 265 bp片段。

2.3 F0及F1代小鼠的獲得與基因型鑒定通過446個受精卵的顯微注射和體內(nèi)移植，出生子鼠44只，出生率9.86%；經(jīng)PCR基因型鑒定，其中4只F0小鼠發(fā)生同源重組，陽性率9.1%。對PCR鑒定同源重組陽性的F1代小鼠，進一步進行基因組的Southern印跡檢測，探針結(jié)合位點和限制性內(nèi)切酶酶切位點見圖2A所示?；蚪MDNA經(jīng)BspHⅠ酶切后，以5′探針雜交顯影，出現(xiàn)9.5 kb條帶者為野生型，4.7 kb條帶者為重組小鼠。基因組DNA經(jīng)BamHⅠ酶切后，以EGFP探針雜交，僅見6.7 kb條帶者為正確重組且無隨機插入的陽性F1代小鼠。Southern印跡結(jié)果顯示編號1～4為陽性F1代小鼠，編號5～7為有隨機插入的重組小鼠，編號8為野生型小鼠（圖3A）。

圖2 CRISPR/Cas 9介導的NPC1L1基因編輯策略及打靶載體酶切鑒定Fig 2 Schematic demonstration for CRISPR/Cas9-mediated editing of NPC1L1 gene and restrictive enzyme digestion analysis of gene targeting vector

圖3 F1代陽性小鼠的Southern印跡檢測和基因型鑒定Fig 3 Southern blotting and genotyping analysis of positive F1 generation mice

進一步鑒定F1代小鼠基因型的引物設計見圖2A，以引物P3F/P3R擴增，野生型基因和FLAGEGFP敲入的等位基因型可分別得到550 bp和1 338 bp的產(chǎn)物。如圖3B所示，只有550 bp產(chǎn)物的是野生型小鼠（+/+）；只有1 338 bp擴增產(chǎn)物的是表達NPC1L1-FLAG-EGFP融合蛋白（簡稱NPC1L1-FG）的純合小鼠（T/T）。

2.4 EGFP可視化示蹤NPC1L1蛋白在小腸上皮細胞的表達特征與野生型小鼠（+/+）相比，純合小鼠（T/T）的空腸絨毛上皮細胞腸腔面可見明顯的綠色熒光，勾勒出清晰的刷狀緣質(zhì)膜輪廓（圖4）。

圖4 空腸組織中NPC1L1-FG融合蛋白的表達分布Fig 4 Distribution of NPC1L1-FG fusion protein in jejunum tissue

3 討論

NPC1L1蛋白在腸道和肝內(nèi)膽道游離膽固醇的攝取中發(fā)揮重要作用。尋找NPC1L1的共作用分子，是解析膽固醇吸收機制的有效策略。因包括大鼠在內(nèi)的嚙齒類動物肝臟組織幾乎不表達NPC1L1蛋白，迄今關(guān)于NPC1L1介導膽固醇吸收機制的研究多以離體大鼠肝癌細胞為模型，導入人NPC1L1基因進行的。有課題組利用NPC1L1-EGFP在大鼠肝癌細胞過表達的細胞模型，經(jīng)免疫沉淀和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)共作用分子Flotillin在介導形成富含膽固醇的NPC1L1微區(qū)（microdomain）膜結(jié)構(gòu)和膽固醇吸收中發(fā)揮重要作用[5]。該課題組還發(fā)現(xiàn)Clathrin的接頭蛋白Numb能特異性識別和結(jié)合NPC1L1蛋白C末端的YVNXXF內(nèi)吞信號肽，從而招募Clathrin以啟動NPC1L1內(nèi)吞[6-7]。此外，該課題組還證實了卸載膽固醇后的NPC1L1從內(nèi)吞循環(huán)體（endocytic recycling compartment，ERC）轉(zhuǎn)運回胞膜時，需要小G蛋白Cdc42[8]和LIM區(qū)和actin結(jié)合蛋白1（LIMdomain and actin binding 1，LIMA1）[9]介導耦聯(lián)含myosin Vb的運輸復合物。然而，目前尚無可體內(nèi)示蹤NPC1L1的動物模型，用以進一步在體探索NPC1L1在膽固醇吸收中的作用機制。

在NPC1L1蛋白的在體功能研究方面，目前常用的小鼠模型為NPC1L1基因全身敲除模型[1-2]，或者在全身敲除的基礎上利用villin-Cre使腸道過表達人源NPC1L1[10]，或者利用載脂蛋白E啟動子在肝臟過表達人源NPC1L1[4，11-12]，以探討腸道或肝臟NPC1L1蛋白在膽固醇代謝中的作用。雖然敲入的外源NPC1L1在標靶組織的定位與內(nèi)源性蛋白的定位基本一致，但是也會發(fā)生脫靶現(xiàn)象。比如胃和腎組織也有villin啟動子活性[10]，因此無法排除這些組織表達的外源NPC1L1在膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)維持中的作用。本研究的NPC1L1-FG工具小鼠是利用CRISPR/Cas9技術(shù)在內(nèi)源性NPC1L1基因末端插入標簽蛋白基因，不會改變內(nèi)源性NPC1L1蛋白的表達分布，因此可以有效避免NPC1L1在標靶組織外表達而造成的實驗假象。

文獻報道的關(guān)于NPC1L1定位的研究，不管是在體的小鼠組織還是離體的細胞模型，均利用熒光標記二抗雜交顯影，這在放大熒光信號的同時也會產(chǎn)生雜信號。本研究的小鼠模型在內(nèi)源性NPC1L1蛋白C端標記上EGFP蛋白，熒光顯微鏡下可見綠色熒光分布在小腸上皮細胞的刷狀緣膜，與文獻報道的NPC1L1蛋白的分布特征一致，說明EGFP敲入能準確示蹤內(nèi)源性NPC1L1蛋白的表達分布。該模型可以方便地利用熒光顯微鏡直接觀察內(nèi)源性NPC1L1蛋白的定位、內(nèi)吞囊泡的形成及其在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，也可避免抗體雜交所致的雜信號的干擾。另外，NPC1L1蛋白還帶有FLAG標簽，利用FLAG抗體可以高效地富集NPC1L1蛋白及其共作用蛋白，結(jié)合蛋白組學分析手段，可以深入分析調(diào)控NPC1L1蛋白表達、降解的分子機制以及參與膽固醇代謝的信號通路。

總之，筆者成功構(gòu)建了腸道特異性表達NPC1L1-FG融合蛋白的小鼠模型，且可利用EGFP標簽蛋白鏡下可視化追蹤NPC1L1蛋白的在體運動軌跡，利用FLAG標簽抗體富集捕獲NPC1L1蛋白及其潛在的共作用蛋白，為今后探討NPC1L1介導的膽固醇和脂溶性維生素穩(wěn)態(tài)維持的分子機制提供有力工具。