復合益生菌酸馬奶的研制及其對腸道菌群的影響

伊再提古麗·外力，阿力米江·奧布力塔力甫，馬建寶，卡麗比奴爾·艾爾肯，古麗巴哈爾·卡吾力

（新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011）

0 引 言

隨著人們生活條件的不斷提升，對食品的要求也越來越高。其中，乳制品在人們?nèi)粘Ｊ澄镏姓紦?jù)重要地位。嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌等是益生菌中常見的菌種，以酸奶為首的乳制品是益生菌最主要的載體[1]。單菌的發(fā)酵過程及產(chǎn)品安全性可控，是近代微生物學的巨大進步，然而單菌株的功能特性，因菌株代謝產(chǎn)物不同而造成明顯差異，具體應用受到限制。近年來，隨著基因組學、代謝組學及腸道微生物理論的發(fā)展，篩選具有特定功能特性的益生菌，將其復配用于功能食品的開發(fā)具有重要的意義。

腸道內(nèi)寄居著大量微生物，包括細菌、真菌及病毒等，其中主要以細菌為主，其數(shù)量可達1015個[2-3]。近年來的研究表明，腸道菌群在人類的多種疾病發(fā)生發(fā)展中扮演了十分重要的角色[4]。腸道菌群作為腸道內(nèi)的正常微生物群，不僅對腸道的生理功能起重要作用，而且對宿主的生理、代謝、免疫、消化和營養(yǎng)的攝取功能也至關(guān)重要[5]。腸道菌群的紊亂不僅與潰瘍性結(jié)腸炎、便秘、腹瀉及大腸癌等腸道消化系統(tǒng)的疾病有關(guān)，同時與代謝性疾病、心腦血管及免疫疾病相關(guān)[6-9]。益生菌對各類消化道等疾病具有一定的治療及預防作用，在改善腸道菌群數(shù)量及菌種組成等方面發(fā)揮著重要的角色。益生菌對人體的作用包括：提高免疫力，促進腸道菌群正?；S持正常的腸道功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低膽固醇水平，延緩機體衰老，改善血脂代謝等[10]。研究表明，益生菌進入人體腸道后，能代謝并產(chǎn)生有機酸，抑制某些有害細菌的生長，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)[11]。

馬奶就營養(yǎng)學角度講，屬于完全蛋白質(zhì)，富含人體所必需的氨基酸(EAA,Essential Amino Acid)9種，與人乳十分相近[12]。由于馬奶具有高乳糖的特點，最適宜生產(chǎn)發(fā)酵乳制品，如酸馬奶[13]。醫(yī)療實踐證明，酸馬奶可增強機體免疫功能，對心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病以及某些癌癥等具有一定的防治作用或輔助療效[14-15]。本研究團隊在前期工作中對鮮馬奶免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞和抗氧化等保健功能進行了系統(tǒng)的研究，并從乳清分離純化具有抗肺癌功能的活性肽，說明了鮮馬奶醫(yī)療價值。為了進一步研究鮮馬奶醫(yī)療價值，豐富市場乳酸菌產(chǎn)品的種類以更加滿足需求，本研究通過單因素和正交實驗設(shè)計篩選復合益生菌酸馬奶發(fā)酵條件、考察其初步穩(wěn)定性，并研究對SD大鼠腸道菌群的影響，為其后期保健功能研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

馬奶粉，新疆特豐藥業(yè)股份有限公司；保加利亞乳酸菌、嗜熱鏈球菌，保加利亞拉科迪納有限公司；5（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌）、7（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌BB-12、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）、10（保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種、鼠李糖乳桿菌）、16種菌粉（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、動物雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧菌、鼠李糖乳桿菌、格氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種），北京川秀科技有限公司；酸馬奶，新疆烏魯木齊南山牧場；MC培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司（LA5600）；MRS培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司（M 8330）；硫酸鈷，天津市大茂化學試劑廠（10124-43-3）；鄰苯二甲酸氫鉀，天津市大茂化學試劑廠（877-24-7）；厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱化學公司（0170ZJ-3）；指示劑，日本三菱化學公司（9212AD）。

PB-10酸度計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；AB135-S電子分析天平，梅特勒METTLER TOLEDO；311恒 溫 培 養(yǎng)，Thermo Fisher Scientific；BCD-239SK DE冰箱，青島海爾股份有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司；DL-1電子萬用爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；sw-cj-2fd超凈臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

選3月齡健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠40只，體質(zhì)量250～350 g左右，由新疆醫(yī)科大學動物中心提供，質(zhì)量許可證號：SCXK(新)2018-0002。所有動物飼養(yǎng)在室溫22～25℃、濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律光照條件下，以普通飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。

1.2 方法

1.2.1 指標測定

1.2.1.1 工藝流程

酸奶瓶滅菌→奶粉復原→殺菌→冷卻→加入菌粉→發(fā)酵→冷卻→冷藏

1.2.1.2 酸度的測定

酸度測定按照中華人民共和國國家標準《GB5009.239—2016食品安全國家標準食品酸度的測定》進行。

1.2.1.3 乳酸菌數(shù)測定

乳酸菌的測定按照中華人民共和國國家標準《GB 4789.35—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行。

1.2.1.4 復合益生菌酸馬奶的評價標準

選擇10名品評人員，取適量試樣置于杯子中，用溫開水漱口，按照表1對復合益生菌酸馬奶品質(zhì)進行打分并通過對復合益生菌酸馬奶的色澤、香味、滋味、組織狀態(tài)4個狀態(tài)進行感官評定，分數(shù)越高說明復合益生菌酸馬奶品質(zhì)越好。

表1 復合益生菌酸馬奶的評價標準

1.2.2 單因素試驗

根據(jù)查閱文獻和預實驗[16-18]，分別以菌種、菌粉添加量、發(fā)酵時間、以及發(fā)酵溫度為考察因素，以復合益生菌酸馬奶的酸度和感官評價為考察指標，每個樣品平行測3組，篩選復合益生菌酸馬奶發(fā)酵條件為進一步進行正交實驗提供數(shù)據(jù)支持。

1.2.2.1 菌種的篩選

將噴干馬奶粉配成10%復原乳，按照2%的菌粉量，在40℃條件下，分別加入2、5、7、10、16種菌粉，發(fā)酵16 h，測定其酸度，以感官評價為考察指標確定菌種。

1.2.2.2 菌粉添加量

將噴干馬奶粉配成10%復原乳，在40℃條件下，加入5種菌，菌添加量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，發(fā)酵16 h，測定其酸度，以感官評價為考察指標確定菌粉添量。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度的篩選

將噴干馬奶粉配成10%復原乳，按照2%的量，加入5種菌粉，分別在36、38、40、42、44℃時發(fā)酵16 h，測定其酸度，以感官評價為考察指標確定溫度。

1.2.2.4 發(fā)酵時間的篩選

將噴干馬奶粉配成10%復原乳，按照2%的量，加入5種菌粉，在40℃條件下，分別發(fā)酵8、12、16、20、24 h，以感官評價為考察指標確定發(fā)酵時間。

1.2.3 正交實驗設(shè)計

以乳酸菌菌種數(shù)（2、5、10種菌）、菌粉添加量（1%、2%、3%）、發(fā)酵溫度（40、42、44℃）、發(fā)酵時間（12、16、20 h）為考察因素，通過L9（34）正交試驗設(shè)計，每個樣品平行測3組，通過酸度和感官評定篩選出最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.4 驗證實驗

根據(jù)正交實驗設(shè)計結(jié)果進行3次重復性試驗，進一步確定復合益生菌酸馬奶發(fā)酵條件。

1.2.5 復合益生菌酸馬奶初步穩(wěn)定性研究

按以上最優(yōu)方法制備復合益生菌酸馬奶，放置在4℃冰箱，每天記錄酸度變化，每隔2 d檢測樣品乳酸菌活菌數(shù)。

1.2.5 復合益生菌酸馬奶對腸道菌群的影響

1.2.5.1 動物分組及干預

將40只SD大鼠按隨機原則分為正常對照組、傳統(tǒng)酸馬奶組（2 mL/100 g）、復合益生菌酸馬奶高、中、低劑量組（3、2、1 mL/100 g），每組8只。各組大鼠連續(xù)灌胃60 d；

1.2.5.2 大鼠糞便的收集

分別于實驗灌胃結(jié)束后，每組選取6只，在無菌條件下同一時間段按摩大鼠腹部使其在規(guī)定時間內(nèi)排便，排糞便一到兩顆粒時收集于無菌EP管中，-80℃凍存。各組大鼠糞便樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行16 s區(qū)域擴增子高通量測序分析。

1.2.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌種的篩選

由圖1可知，當其他因素相同，菌種數(shù)量分別為2、5、7、10、16種時，感官評分分別為81.4、84.5、81.1、81.9、81.2分。5種菌感官評分最高，其酸奶顏色呈乳白色，乳體均勻一致，無沉淀物，馬乳香清雅，純正，酸味兒適口，無異味。其次是10種菌種制備的益生菌酸馬奶和2種菌種制備的益生菌酸馬奶。

圖1 菌種對益生菌酸馬奶品質(zhì)的影響

2.1.2 菌粉添加量

由圖2可知，當其他因素相同，菌粉添加量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%時，酸度隨菌粉添加量呈增長趨勢。感官評分分別為84.1、83.5、86.4、83.7、84.7分。由發(fā)酵后產(chǎn)品的評分可以看出，當菌粉添加量為2%時，產(chǎn)品的感官評分最高。當菌量為2%時，益生菌酸馬奶味道純正，其次是3%和1%。

圖2 菌量對益生菌酸馬奶品質(zhì)的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度的篩選

由圖3可知，當其他因素相同，發(fā)酵溫度分別為36、38、40、42、44℃時，酸度隨發(fā)酵溫度呈增長趨勢。感官評分分別為82.8、83.2、84.7、84、84.2分。由發(fā)酵后產(chǎn)品的評分可以看出，當發(fā)酵溫度為40℃時，產(chǎn)品的感官評分最高，其次是42℃和44℃。

圖3 發(fā)酵溫度對益生菌酸馬奶品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵時間的篩選

由圖4可知，當其他因素相同，發(fā)酵時間分別為8、12、16、20、24 h時，酸度隨發(fā)酵時間的增大而增大。感官評分分別為82.7、84.1、85.5、84.3、82.1分。由發(fā)酵后產(chǎn)品的評分可以看出，當發(fā)酵時間為16 h時，產(chǎn)品的感官評分最高，其次是12 h和20 h。

圖4 發(fā)酵時間對益生菌酸馬奶品質(zhì)的影響

通過表3和表4可知，以酸度為評價指標得出的結(jié)果無顯著性差異，故無統(tǒng)計學意義。以感官評分為評價指標時，通過正交試驗正交表中極差R值和方差分析表中的方差分析，4種因素中對益生菌酸馬奶質(zhì)量影響大小的順序A＞B＞C＞D，各因素對復合益生菌酸馬奶的影響以菌種最大，其次為菌添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間。其中菌種對本實驗有顯著性影響。故確定益生菌酸馬奶研制的最佳工藝為A2B2C2D3，即5種菌種，菌粉添加量為2%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為20 h。在此條件下制備的復合益生菌酸馬奶，顏色呈乳白色，乳體均勻一致，無沉淀物，馬乳香清雅，純正，酸味兒適口，口感風味較佳。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

（續(xù)表3）

表4 方差分析結(jié)果

2.2 驗證實驗

發(fā)酵條件為5種菌種（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌），菌粉添加量為2%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為20 h，進行3次平行實驗，酸度為55.4°T，感官評分為89.6，因此確定A2B2C2D3為最佳條件。

2.3 儲藏期穩(wěn)定性研究

2.3.1 儲藏期酸度變化

由圖5可知，益生菌酸馬奶制備好第一天酸度是最高的，味道最純正，顏色呈乳白色，乳體均勻一致，酸味兒適口，無異味。第13天開始酸度基本保持不變，15 d以內(nèi)酸度符合標準（DBS 65/**-2019），說明本研究優(yōu)化所得的益生菌酸馬奶在貨架期內(nèi)口感和風味比較穩(wěn)定，滿足市場銷售需要。

圖5 冷藏過程中酸度的變化

2.3.2 儲藏期乳酸菌數(shù)的變化

早期研究發(fā)現(xiàn)酸奶等發(fā)酵乳制品具有改善胃腸炎的功效，甚至具有延年益壽的作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)這些發(fā)酵乳制品的潛在作用和機制與乳酸菌等細菌的存在密切相關(guān)，其發(fā)酵產(chǎn)物可以抑制腸道病原體產(chǎn)生的毒素，促進宿主細胞的健康[19]。由圖6可以看出本研究制備的益生菌酸馬奶乳酸菌在整個儲藏期是比較穩(wěn)定的，乳酸菌數(shù)均達到1×108CFU/g以上。

圖6 冷藏過程中乳酸菌數(shù)變化

2.3.3 復合益生菌酸馬奶對腸道菌群的影響

2.3.3.1 Alpha多樣性分析

由圖7稀釋曲線可以看出隨著測序量的增加，物種的豐富度增加呈平緩趨勢提示本次測序深度充分已覆蓋樣本中的所有物種。

圖7 各組樣本的稀釋曲線

由圖8可以看出，與正常對照組相比，傳統(tǒng)酸馬奶組與復合益生菌酸馬奶高、中劑量組的Simpson指數(shù)無顯著性差異，而低劑量的酸馬奶顯著高于正常對照組（P<0.05）。說明低劑量的酸馬奶可提高腸道菌群的多樣性。正常對照組與傳統(tǒng)酸馬奶組以及復合益生菌酸馬奶高、中、低劑量組相比Shannon指數(shù)均無顯著性差異，但低劑量組與傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶高和中劑量組相比，Shannon指數(shù)顯著降低（P<0.05）；正常對照組和傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶中、低劑量組均無顯著性變化，高劑量組高于其他組但無顯著性差異（P>0.05）。

圖8 各組大鼠腸道菌群的Simpson、Shannon、Chao1多樣性指數(shù)展示

2.3.3.2 Beta多樣性分析

當前所展示的平面坐標系，可解釋所有樣品間總差異的19.6%，各組間存在顯著差異(P<0.01)，如圖9～10所示。從圖中可以看出，傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶高、中劑量組的聚在一起，低劑量組與正常對照組距離較遠。說明高、中劑量的復合益生菌酸馬奶和傳統(tǒng)酸馬奶對腸道菌群的多樣性影響比較接近。

圖9 各組大鼠腸道菌群的PCoA展示

圖10 各組大鼠腸道菌群的CCoA展示

2.3.3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

在門水平，選取豐度前4的細菌進行展示，厚壁菌門在正常對照組、傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶高、中、低劑量組中的相對豐度分別為81.21%、73.74%、69.62%、67.68%、84.32%，擬桿菌門在正常對照組、傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶高、中、低劑量組中的相對豐度分別為14.29%、22.78%、26.92%、29.78%、12.72%，如圖11所示；在屬水平豐度排名前10的細菌分別是Ligilactobacillus、Duncaniella、Lactobacillus、Bacteroides、Ruminococcus、Romboutsia、Desulfovibrio、Muribaculum、Limosilactobacillus，如圖12所示。

圖11 各組大鼠腸道菌群在門水平下的組成

圖12 各組大鼠腸道菌群在屬水平下的組成

2.3.3.4 腸道菌群的差異性分析

正常對照組與傳統(tǒng)酸馬奶組相比，在門水平下無顯著性差異；在屬水平下，傳統(tǒng)酸馬奶組升高了Roseburia、Bacteroides的豐度，顯著降低了Turicibacter、Romboutsia的豐度，如圖13所示。復合益生菌酸馬奶高劑量組跟正常對照組相比，在門水平下，顯著升高了厚壁菌門（Bacteroidetes）的豐度；在屬水平，顯著升高了Duncaniella、Oscillibacter的豐度，顯著降低了Clostridium_sensu_stricto、Turicibacter、Romboutsia的豐度，如圖14所示。復合益生菌酸馬奶中劑量組與正常對照相比，在門水平下，顯著升高了擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度；在屬水平下，顯著升高了Acetivibrio、Duncaniella的豐度，顯著降低了Turicibacter，如圖15所示。低劑量組與正常對照相比，在門水平下，無顯著差異；在屬水平下，顯著降低了Clostridium_sensu_stricto、Turicibacter、Romboutsia的豐度如圖16所示。

圖13 正常對照組與傳統(tǒng)酸馬奶組LEfSe結(jié)果

圖14 正常對照組與高劑量組LEfSe結(jié)果

圖15 正常對照組與復合益生菌酸馬奶中劑量組LEfSe結(jié)果

圖16 正常對照組與復合益生菌酸馬奶低劑量組LEfSe結(jié)果

3 結(jié) 論

人們生活水平的提高對食品的保健功能提出了更高要求，復合益生菌酸奶逐漸被人們所重視。優(yōu)化復合益生菌酸奶的發(fā)酵條件成為目前人們研究的重點。酸馬奶是一種以馬奶為基料發(fā)酵的低酒精含量的發(fā)酵乳制品，一般通過乳酸菌和酵母菌混合酵制而成[20]。傳統(tǒng)酸馬奶是通過木材器具、動物皮或瓷器中自然發(fā)酵制成的[21]。本研究以感官評分為指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗確定了復合益生菌酸馬奶配方和工藝，復合益生菌酸馬奶研制的最佳工藝為添加5種菌種，菌粉添加量為2%，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時間為20 h，制備方法簡單，口感清爽。在15 d之內(nèi)酸度和乳酸菌數(shù)量均符合標準（DBS 65/**-2019），初步穩(wěn)定性良好，乳酸菌數(shù)均達1×108CFU/g以上，說明復合益生菌酸馬奶所選發(fā)酵條件符合要求，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

寄生在腸道內(nèi)的細菌是一類具有非常重要功能的細菌，對人類生活方式有較大的影響。腸道菌群不僅可以分解食物和存儲脂肪，還能促進免疫系統(tǒng)發(fā)育、血管合成以及對神經(jīng)系統(tǒng)進行調(diào)控。擬桿菌是廣泛分布在哺乳動物體內(nèi)的細菌，屬于人類腸道中主要細菌，在糖尿病、肥胖[22-23]等疾病中發(fā)揮有益作用。本次研究采用不同劑量的復合益生菌酸馬奶及傳統(tǒng)酸馬奶對正常大鼠進行灌胃，探究其對腸道菌群的影響并發(fā)現(xiàn)復合益生菌酸馬奶高、中劑量組在門水平上，顯著升高了擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度，在屬水平上顯著升高了Duncaniella豐度。低劑量組在屬水平上，顯著升高乳酸桿菌（Lactobacillus），增加Ligilactobacillus、Limosilactobacillus等有益菌豐度。近期研究發(fā)現(xiàn)Ligilactobacillus、Limosilactobacillus被分列為乳酸桿菌里的新菌屬，推測可能對機體產(chǎn)生益生作用[24]。本研究采用Chao1、Simpson、Shannon多樣性指數(shù)來反映腸道菌群的豐富度和多樣性，復合益生菌酸馬奶對正常大鼠腸道的影響研究中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)酸馬奶組、復合益生菌酸馬奶高、中劑量組對腸道菌群的α多樣性沒有顯著性影響，提示這些酸奶對正常大鼠腸道菌群的整體性結(jié)構(gòu)影響不大；低劑量復合益生菌酸馬奶可以顯著升高Simpson指數(shù)，說明低劑量的復合益生菌酸馬奶影響腸道菌群的多樣性。β多樣性分析顯示，高、中劑量的復合益生菌酸馬奶和傳統(tǒng)酸馬奶腸道菌群的多樣性影響比較接近。綠膿桿菌（Turicibacter）是厚壁菌門中的一個屬，多項研究顯示該菌屬于促炎菌[25-27]。余莉[28]團隊研究顯示，與青年健康組相比，老年人腸道中的Turicibacter顯著升高。在抑郁癥和肥胖癥的小鼠模型中，Turicibacter豐度顯著升高[29]。David Ma[30]研究發(fā)現(xiàn)生酮飲食降低阿爾茲海默癥的風險與腸道中Turicibacter的相對豐度降低有關(guān)。本研究中復合益生菌酸馬奶高、中、低劑量組在屬水平上顯著降低了Turicibacter，進一步說明了酸馬奶對健康的好處。綜上所述，復合益生菌酸馬奶在一定程度上可通過調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)，進而影響機體健康。

隨著酸馬奶的商業(yè)化，其相關(guān)產(chǎn)品已被廣大消費者所認知與接受，且其銷售地區(qū)范圍也在不斷擴大。酸馬奶對人體健康的有益功能已被證明。然而，對酸馬奶的功能研究不應忽視。腸道中數(shù)以萬億計的微生物，對人類健康也有重大影響。酸馬奶中的功能性成分可能會與這些腸道微生物群相互作用，對人類健康發(fā)揮積極作用。本研究旨在探討酸馬奶對腸道微生物區(qū)系組成的影響，為進一步研究酸馬奶的功能提供依據(jù)。