“雞尾酒”式混合抗生素對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響

韓寶蒼,陳志彬,張躍恒,林志芬,孫昊宇

“雞尾酒”式混合抗生素對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響

韓寶蒼1,陳志彬1,張躍恒1,林志芬1,孫昊宇2*

(1.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,有機(jī)復(fù)合污染控制工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200444)

選擇四環(huán)素、磺胺、磺胺增效劑3類常用抗生素,以其對(duì)大腸桿菌()的單一興奮效應(yīng)(hormesis)最大促進(jìn)效應(yīng)對(duì)應(yīng)濃度(HCmax)配制等HCmax比的二元及三元混合體系,探究混合體系對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和耐藥性(突變、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移)的聯(lián)合效應(yīng).結(jié)果表明,二元混合抗生素對(duì)生長(zhǎng)和接合轉(zhuǎn)移頻率起到協(xié)同抑制,對(duì)的突變頻率起協(xié)同刺激;三元混合抗菌劑對(duì)這三種效應(yīng)均協(xié)同抑制.因此,推測(cè)二元混合體系會(huì)導(dǎo)致毒性和耐藥性風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)增加;三元混合體系會(huì)導(dǎo)致毒性風(fēng)險(xiǎn)增加、耐藥性風(fēng)險(xiǎn)降低.

混合抗生素；細(xì)菌耐藥性；hormesis；突變；接合轉(zhuǎn)移

抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、畜禽養(yǎng)殖等行業(yè)[1].然而,目前抗生素大規(guī)模生產(chǎn)與使用導(dǎo)致大量抗生素經(jīng)由廢水排放、畜禽排泄等途徑進(jìn)入環(huán)境中[2],增加細(xì)菌耐藥性發(fā)生頻率,加速固有抗性微生物和抗性基因的擴(kuò)散[3].細(xì)菌耐藥性污染的傳播導(dǎo)致臨床治療中常規(guī)抗生素劑量無(wú)法抑制細(xì)菌而需要加大抗生素用量,甚至誘導(dǎo)了超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn),這對(duì)人類健康構(gòu)成極大危害.因此,如何控制細(xì)菌耐藥性的發(fā)生與傳播是目前亟待解決的問(wèn)題.環(huán)境中細(xì)菌耐藥性污染主要以抗性基因作為媒介[4].已有文獻(xiàn)表明,抗性基因的產(chǎn)生和傳播往往與環(huán)境中的抗生素殘留密切相關(guān)[5].環(huán)境中抗生素濃度越大,抗性基因往往污染越嚴(yán)重.因此,有學(xué)者認(rèn)為,可以通過(guò)減少抗生素使用量從源頭降低抗性基因的產(chǎn)生[6].

“雞尾酒療法”作為一種藥物使用策略,指聯(lián)合使用3種或3種以上的藥物進(jìn)行治療,其可以減少單一用藥造成生物體對(duì)藥物的依賴并加強(qiáng)療效,在源頭上減少耐藥性的產(chǎn)生[7].因此,依照“雞尾酒療法”將低劑量抗生素混合使用,可能是臨床上保持藥效、減少細(xì)菌耐藥性的抗生素聯(lián)用手段.然而,按照“雞尾酒療法”使用抗生素后,會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入環(huán)境中的抗菌劑會(huì)以低劑量、混合的形式存在.在以往的研究中,低劑量抗生素對(duì)細(xì)菌往往會(huì)產(chǎn)生低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的雙向劑量-效應(yīng),即hormesis效應(yīng)[8].已有文獻(xiàn)表明,hormesis效應(yīng)在抗生素作用于大腸桿菌()、費(fèi)氏弧菌等多種細(xì)菌時(shí)普遍存在[5,9].

四環(huán)素類(TCs)、磺胺增效劑類(SAPs)與磺胺類(SAs)抗生素是常見(jiàn)的臨床使用抗生素,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出很好的抑菌效果.因此,本文以細(xì)菌耐藥突變、RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移表征細(xì)菌耐藥性,選擇可能作為“雞尾酒療法”配方的四環(huán)素類(3種)、磺胺增效劑類(3種)和磺胺類(1種)抗生素作為受試化合物,以經(jīng)典模式生物為受試生物,探究單一抗生素對(duì)生長(zhǎng)與突變、接合轉(zhuǎn)移的影響;將單一抗生素的hormesis促進(jìn)效應(yīng)最高的濃度點(diǎn)(HCmax)按等HCmax比進(jìn)行二元或三元混合,探究混合抗生素對(duì)生長(zhǎng)與突變、接合轉(zhuǎn)移的影響和機(jī)制;并與單一抗生素毒性與細(xì)菌耐藥性進(jìn)行對(duì)比,借鑒獨(dú)立作用(IA)模型,判別單一抗生素在等HCmax比進(jìn)行混合時(shí)對(duì)生長(zhǎng)及耐藥性的聯(lián)合作用方式.本文旨在探究抗生素“雞尾酒”暴露體系對(duì)細(xì)菌毒性與耐藥性的影響,為實(shí)際環(huán)境中低濃度抗生素的聯(lián)合作用和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與生物

實(shí)驗(yàn)所用抗生素購(gòu)自 Sigma-Aldrich 化學(xué)制品有限公司(上海,中國(guó)),純度為95%以上.受試化合物的基本信息見(jiàn)表1.購(gòu)于 Biovetor 生物科技有限公司(北京,中國(guó)).毒性及突變實(shí)驗(yàn)所用生物為野生型MG1655.接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)所用供體菌是(RP4),其RP4質(zhì)粒上攜帶有卡那霉素、氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性基因,受體菌是具有能夠穩(wěn)定遺傳的萘啶酮酸(Nal)耐藥標(biāo)記的(Nal).

表1 抗生素信息及單一毒性

1.2 毒性實(shí)驗(yàn)

精確稱取測(cè)試抗生素,使用二甲基亞砜(DMSO)助溶,隨后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯化鈉溶液稀釋成等對(duì)數(shù)濃度梯度的系列溶液.取80μL稀釋后的化合物溶液加入到100孔板中,同時(shí)加入80μL培養(yǎng)基及40μL稀釋后的菌液,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行,設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見(jiàn)表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見(jiàn)表3.每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)空白對(duì)照,操作同上,僅以80μL氯化鈉溶液代替稀釋后的抗生素溶液.于Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀(Multiskan GO,美國(guó)賽默飛世爾科技公司)中37℃震蕩培養(yǎng),第22h測(cè)試并記錄600nm處的光密度值(OD600)的讀數(shù).

抗生素對(duì)的生長(zhǎng)促進(jìn)率由式(1)計(jì)算得出:

式中:HP表示抗生素對(duì)的生長(zhǎng)促進(jìn)率,OD600,0表示空白對(duì)照組的OD600值,OD600,表示各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的OD600值.

1.3 突變實(shí)驗(yàn)

突變實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)條件與毒性實(shí)驗(yàn)相同.將含有溶液的100孔板在Bioscreen分析儀中于37℃培養(yǎng)22h后,取20μL稀釋106倍的菌液加至不含任何抗生素的固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫靜置培養(yǎng)12h后,進(jìn)行菌落形成單位(CFU)計(jì)數(shù),計(jì)算總菌數(shù).另取20μL濃縮3倍的菌液加至含有40mg/L利福平的固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫靜置培養(yǎng)12h后進(jìn)行突變子CFU計(jì)數(shù).對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度點(diǎn)均設(shè)置3個(gè)平行.設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見(jiàn)表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見(jiàn)表3.

抗生素對(duì)的突變頻率促進(jìn)率的由式(2)、式(3)計(jì)算得出:

式中:為突變頻率;m為突變子個(gè)數(shù),CFU/mL;t為總菌數(shù),CFU/mL;

式中:MP為抗生素對(duì)的突變頻率促進(jìn)率;i和c分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組突變頻率.

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度組數(shù)及范圍

1.4 接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)

將RP4質(zhì)粒供體菌與受體菌分別接種至含有相應(yīng)抗生素的單倍LB培養(yǎng)基中,在37℃條件下以180r/min振蕩培養(yǎng)9h,用同樣體積的生理鹽水進(jìn)行2次洗菌,去除多余的培養(yǎng)基及抗生素,調(diào)節(jié)其OD600值為0.5左右,再以供體菌:受體菌=1:2的比例混合制成工作菌液.

配置200μL的培養(yǎng)體系,其中包含40μL的單一或混合抗生素溶液、100μL的培養(yǎng)基和60μL的工作菌液,混勻后靜置培養(yǎng)8h.之后進(jìn)行梯度稀釋,分別取稀釋后的菌液30μL添加至含有萘啶酮酸和卡那霉素的篩選板上,37℃靜置培養(yǎng)12h后分別進(jìn)行接合子CFU計(jì)數(shù)與受體菌CFU計(jì)數(shù).對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行.設(shè)置的濃度組數(shù)及濃度范圍見(jiàn)表2.混合抗生素各抗生素的比例和濃度值見(jiàn)表3.

抗生素對(duì)E. coli的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率由式(4)、式(5)計(jì)算得出:

式中:為RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率;c為接合子個(gè)數(shù), CFU/mL;r為受體菌個(gè)數(shù),CFU/mL;

式中:RP為抗生素對(duì)E. coli的RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率;i和c分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率.

表3 化合物混合液中各抗生素的比例和濃度值

注:“-”表示無(wú)數(shù)據(jù).

1.5 特征參數(shù)表征

抗生素對(duì)的毒性效應(yīng)曲線如圖1a所示.根據(jù)單一抗生素的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,當(dāng)生長(zhǎng)抑制率達(dá)到50%時(shí),在圖1a上對(duì)應(yīng)濃度為EC50; HPmax在圖1a上對(duì)應(yīng)的濃度為HCmax.混合抗生素濃度為HCmix在圖1a上對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)促進(jìn)率為HPmix.

圖1 抗生素對(duì)E. coli的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)曲線

抗生素對(duì)的突變效應(yīng)曲線如圖1b所示.單一抗生素MPmax在圖1b上對(duì)應(yīng)濃度為MCmax.單一抗生素處于HCmax濃度時(shí)在圖1b上對(duì)應(yīng)的突變促進(jìn)率為MP-HCmax.混合抗生素處于HCmix時(shí)在圖1b上對(duì)應(yīng)的突變促進(jìn)率為MP-HCmix.

抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)曲線如圖1c所示.單一抗生素RPmax圖1c上對(duì)應(yīng)的濃度為RCmax.單一抗生素處于HCmax濃度時(shí)在圖1c對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率為RP-HCmax.混合抗生素處于HCmix時(shí)在圖1c上對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率為RP-HCmix.

本文涉及到的生長(zhǎng)、突變與接合轉(zhuǎn)移指標(biāo)參數(shù)及其具體釋義在表4中列出.

1.6 聯(lián)合作用判別

混合暴露實(shí)驗(yàn)中,由于TCs與SAs、SAPs作用通路不同,基于IA模型對(duì)混合抗生素的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)的聯(lián)合作用方式進(jìn)行判別.

基于IA模型的判別方法,構(gòu)造式(6)計(jì)算理論毒性效應(yīng)HPmix-IA.

式中:HPmax(i)是第種抗生素單一暴露時(shí)產(chǎn)生的hormesis最大促進(jìn)效應(yīng).將混合抗生素實(shí)際的HPmix與計(jì)算得到的HPmix-IA進(jìn)行比較,當(dāng)實(shí)際的HPmix小于HPmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到協(xié)同作用;當(dāng)實(shí)際的HPmix等于HPmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到相加作用;當(dāng)實(shí)際的HPmix大于HPmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到拮抗作用.

相應(yīng)地,構(gòu)造式(7)計(jì)算理論突變效應(yīng)MP- HCmix-IA.

式中:MP-HCmax(i)是第種抗生素單一暴露時(shí)在HCmax濃度處的突變頻率促進(jìn)率.將混合抗生素實(shí)際的MP-HCmix與計(jì)算得到的MP-HCmix-IA進(jìn)行比較,當(dāng)實(shí)際的MP-HCmix小于MP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的突變促進(jìn)效應(yīng)起到拮抗作用;當(dāng)實(shí)際的MP-HCmix等于MP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的突變促進(jìn)效應(yīng)起到相加作用;當(dāng)實(shí)際的MP-HCmix大于MP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的突變促進(jìn)效應(yīng)起到協(xié)同作用.

此外,構(gòu)造式(8)計(jì)算理論接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)RP- HCmix-IA.

式中:RP-HCmax(i)是第種抗生素單一暴露時(shí)在HCmax濃度處的接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率.將混合抗生素實(shí)際的RP-HCmix與計(jì)算得到的RP-HCmix-IA進(jìn)行比較,當(dāng)實(shí)際的RP-HCmix小于RP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)效應(yīng)起到拮抗作用;當(dāng)實(shí)際的RP-HCmix等于RP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)效應(yīng)起到相加作用;當(dāng)實(shí)際的RP-HCmix大于RP-HCmix-IA時(shí),認(rèn)為混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)效應(yīng)起到協(xié)同作用.

表4 E. coli生長(zhǎng)與突變、接合轉(zhuǎn)移指標(biāo)參數(shù)釋義

2 結(jié)果與討論

2.1 單一抗生素對(duì)E. coli的生長(zhǎng)及耐藥性的影響

2.1.1 單一抗生素對(duì)生長(zhǎng)的影響 單一抗生素對(duì)生長(zhǎng)的EC50見(jiàn)表1,各抗生素毒性大小順序?yàn)?SDX < OH < OMP < DVD < DH < TH < TMP.在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),所有單一抗生素均對(duì)的生長(zhǎng)表現(xiàn)出hormesis效應(yīng), hormesis效應(yīng)的HPmax與HCmax數(shù)據(jù)見(jiàn)表5,其中HPmax的大小順序?yàn)門H < DVD < TMP < OH < DH < OMP < SDX;HCmax的大小順序?yàn)門H < TMP < DH < DVD < OH < SDX < OMP.依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,TCs、SAs、SAPs抑制生長(zhǎng)的機(jī)制如下(圖2a):TCs經(jīng)由細(xì)胞外膜的親水性孔,通過(guò)內(nèi)膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞,與核糖體30S亞基16s RNA上的A位點(diǎn)結(jié)合,阻止氨基酰-tRNA進(jìn)入核糖體,從而抑制肽鏈延長(zhǎng)與蛋白質(zhì)合成[10];SAs與對(duì)氨基苯甲酸(PABA)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合二氫蝶酸合成酶(DHPS),阻礙二氫葉酸(DHF)的合成,進(jìn)而抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)與DHF的結(jié)合[11-12],阻礙四氫葉酸(THFA)的合成,最終抑制的生長(zhǎng)[13];SAPs作用通路與SAs相似,SAPs通過(guò)與DHF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DHFR從而阻礙THFA合成,抑制生長(zhǎng)[14-15].以往的研究表明,活性氧簇(ROS)在抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的過(guò)程中也起重要作用.ROS在低濃度抗生素下對(duì)細(xì)菌起到保護(hù)作用,而在高濃度抗生素下則協(xié)同抗生素抑菌[16].因此推測(cè),當(dāng)暴露于抗生素時(shí),低劑量抗生素會(huì)引起ROS水平輕微升高,使ROS扮演信號(hào)分子的角色,調(diào)控的相關(guān)通路從而引起生長(zhǎng)促進(jìn)作用[17],最終表現(xiàn)出hormesis劑量-效應(yīng)關(guān)系.

2.1.2 單一抗生素對(duì)突變的影響 單一抗生素均能促進(jìn)的突變效應(yīng),其對(duì)應(yīng)的MPmax與MCmax見(jiàn)表5.其中各抗生素MPmax的大小順序?yàn)镾DX < DH < TH < OH < TMP < OMP < DVD;MCmax的大小順序?yàn)镺H < TH < TMP < DH < OMP < SDX < DVD.基于以往的研究,推測(cè)TCs、SAs、SAPs促進(jìn)突變頻率的可能機(jī)制如下(圖2b):對(duì)TCs的耐藥性是由16S rRNA基因?qū)?yīng)位點(diǎn)上AGA926-928發(fā)生單或多堿基突變引起,該區(qū)域在核糖體螺旋環(huán)31(helix31)處,是TCs與16S rRNA主要的結(jié)合位點(diǎn)[18]; helix31區(qū)域的核苷酸突變會(huì)影響16S rRNA與TCs的親和力,從而使對(duì)TCs產(chǎn)生耐藥性[19].SAs、SAPs阻礙THFA生物合成,從而減少嘌呤與嘧啶的合成,在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致堿基的錯(cuò)配,并最終促進(jìn)的突變頻率[20].此外,當(dāng)TCs、SAPs、SAs濃度超過(guò)閾值時(shí),抗生素對(duì)產(chǎn)生明顯的生長(zhǎng)毒性,致使細(xì)菌總數(shù)與突變體數(shù)量大幅下降,進(jìn)而導(dǎo)致各抗生素對(duì)突變頻率促進(jìn)作用的下降[21].

表5 單一抗生素毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)相關(guān)參數(shù)匯總

圖2 SAs、SAPs、TCs的毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移作用通路 [15,20,24]

PABA,對(duì)氨基苯甲酸;DHPS,二氫蝶酸合成酶;DHF,二氫葉酸;DHFR,二氫葉酸還原酶;THFA,四氫葉酸

2.1.3 單一抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 單一抗生素均能促進(jìn)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng),其對(duì)應(yīng)的RPmax與RCmax見(jiàn)表5.其中,各抗生素RPmax的大小順序?yàn)镾DX < DVD < TMP < OMP < DH < TH < OH; RCmax的大小順序?yàn)镺MP < DVD < TMP < SDX < DH < OH < TH.TCs、SAPs、SAs促進(jìn)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率的可能機(jī)制如下(圖2c):暴露在TCs藥物中含有RP4質(zhì)粒的供體菌,可以通過(guò)特異性識(shí)別RP4質(zhì)粒上的序列[22],促使閉合環(huán)狀DNA雙鏈進(jìn)行解螺旋[23],質(zhì)粒上的R,A,1和2等基因得以表達(dá),從而促進(jìn)質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移.當(dāng)TCs濃度達(dá)到一定閾值時(shí),抗生素對(duì)供體菌與受體菌產(chǎn)生明顯的生長(zhǎng)毒性,致使接合子數(shù)量大幅下降,進(jìn)而導(dǎo)致TCs對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)作用的下降.SAPs、SAs的暴露可引起體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)損傷,觸發(fā)SOS反應(yīng)[24-25]. SOS反應(yīng)可能上調(diào)RP4質(zhì)粒編碼基因,以及控制供體和受體細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的基因,從而促進(jìn)RP4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移[26-27].當(dāng)SAPs、SAs脅迫逐漸增大,SOS反應(yīng)不能完全修復(fù)DNA與蛋白質(zhì)損傷,可能影響供體與受體菌活性,甚至是接合子活性,導(dǎo)致SAPs、SAs對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率的促進(jìn)作用逐漸降低[28-30].

2.2 二元及多元抗生素混合對(duì)E. coli的生長(zhǎng)及耐藥性的影響

2.2.1 混合抗生素對(duì)生長(zhǎng)的影響 根據(jù)單一抗生素毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將3類抗生素按照等HCmax濃度比進(jìn)行混合,毒性效應(yīng)結(jié)果如圖3所示.在圖3中利用虛線表征當(dāng)單一抗生素以濃度HCmax混合時(shí)的混合抗菌劑濃度HCmix,找到其對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)促進(jìn)率HPmix,可以看出:TH&SDX組合的HCmix虛線落在無(wú)效應(yīng)區(qū)間內(nèi),表示TH&SDX二元混合在HCmix對(duì)無(wú)毒性效應(yīng);其余5種組合的HCmix垂線均落在促進(jìn)率為負(fù)的區(qū)間范圍(即抑制區(qū)間范圍)內(nèi),表示該5種組合在HCmix對(duì)的生長(zhǎng)有抑制效應(yīng),且抑制率均達(dá)到80%以上,說(shuō)明混合抗生素能夠明顯抑制的生長(zhǎng).為進(jìn)一步明確混合抗生素對(duì)生長(zhǎng)的聯(lián)合作用方式,計(jì)算得到IA模型下混合抗生素的HPmix-IA,并與實(shí)際HPmix進(jìn)行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6.二元混合抗生素和三元混合抗生素的HPmix均小于HPmix-IA,說(shuō)明混合抗生素對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到協(xié)同作用.由單一抗生素對(duì)的毒性作用機(jī)制可以看出(圖2),SAs、SAPs分別與DHPS、DHFR結(jié)合后,會(huì)抑制THFA的合成[31].當(dāng)阻斷THFA的合成時(shí),氨基酸甲?；艿阶璧K,從而使核蛋白的合成受阻.同時(shí),TCs與核糖體30S亞基16s RNA上A位點(diǎn)結(jié)合,阻止氨基酰-tRNA進(jìn)入核糖體A位置,抑制肽鏈延長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成[14].因此,TCs與SAs、SAPs的聯(lián)用能夠共同抑制蛋白質(zhì)合成,對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到協(xié)同作用.

表6 混合抗生素毒性、突變與接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)的實(shí)際與計(jì)算促進(jìn)率

圖3 混合抗生素對(duì)E. coli生長(zhǎng)的毒性效應(yīng)

2.2.2 混合抗生素對(duì)突變的影響 如圖4所示, 利用虛線表征當(dāng)單一抗生素以濃度HCmax混合時(shí)的混合抗生素濃度HCmix,找到其對(duì)應(yīng)的突變頻率促進(jìn)率MP-HCmix,可以看出:混合抗生素依然能夠促進(jìn)突變的產(chǎn)生.為進(jìn)一步明確混合抗生素對(duì)突變的聯(lián)合作用方式,計(jì)算得到IA模型下混合抗生素的MP-HCmix-IA,并與實(shí)際MP-HCmix進(jìn)行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6.二元混合抗生素的MP- HCmix均大于MP-HCmix-IA,說(shuō)明二元混合抗生素對(duì)促進(jìn)突變頻率起到協(xié)同作用;三元混合抗生素的MP-HCmix均小于MP-HCmix-IA,說(shuō)明三元混合抗生素對(duì)促進(jìn)的突變頻率起到拮抗作用.由單一抗生素對(duì)的突變作用機(jī)制可以看出(圖2),TCs造成16S rRNA上helix31區(qū)域的核苷酸突變;SAs、SAPs阻礙THFA生物合成,減少嘌呤與嘧啶合成,導(dǎo)致堿基錯(cuò)配.TCs&SAs及TCs&SAPs的二元協(xié)同是核苷酸突變與堿基錯(cuò)配共同作用的結(jié)果;SAs&SAPs的二元協(xié)同則是在于其均可阻礙THFA合成并最終導(dǎo)致堿基錯(cuò)配從而起到協(xié)同作用.然而,當(dāng)加入第3種抗生素時(shí),三元聯(lián)合對(duì)的生長(zhǎng)起到明顯抑制作用,影響細(xì)菌核酸和氨基酸的生成,導(dǎo)致突變所需要的蛋白供給減少,進(jìn)而抑制的突變頻率上升.

2.2.3 混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響 如圖5所示, 利用虛線表征當(dāng)單一抗生素以濃度HCmax混合時(shí)的混合抗生素濃度HCmix,找到其對(duì)應(yīng)的接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率RP-HCmix,可以看出: TH&SDX組合的HCmix虛線落在接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率促進(jìn)區(qū)間,表示TH&SDX二元混合在此濃度下促進(jìn)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生;其余5種組合的HCmix垂線均落在接合轉(zhuǎn)移頻率促進(jìn)率抑制區(qū)間,表示該5種組合此濃度下可抑制的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生.為進(jìn)一步明確混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的聯(lián)合作用方式,計(jì)算得到IA模型下混合抗生素的RP-HCmix-IA,并與實(shí)際RP-HCmix進(jìn)行比較,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6.二元抗生素與三元抗生素的RP-HCmix均小于RP-HCmix-IA,說(shuō)明以上組合對(duì)促進(jìn)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率均起到拮抗作用.由單一抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可以看出(圖2):TCs使供體菌RP4質(zhì)粒解螺旋,R,A,1和2基因表達(dá),促進(jìn)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移;SAs、SAPs觸發(fā)SOS反應(yīng),上調(diào)胞內(nèi)基因,促進(jìn)RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移.當(dāng)混合抗生素濃度處于HCmix時(shí),低濃度抗生素聯(lián)用使細(xì)菌總數(shù)減少,從而影響供體和受體細(xì)菌的活性,甚至是結(jié)合子的活性,使TCs解螺旋的RP4質(zhì)粒減少,SOS上調(diào)胞內(nèi)基因減少,從而使RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率降低[32],表現(xiàn)為混合抗生素對(duì)的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)的拮抗作用.

圖4 混合抗生素對(duì)E. coli的突變效應(yīng)

2.3 基于“雞尾酒”暴露體系的混合抗生素的可能環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)

二元混合抗生素處于HCmix濃度時(shí),實(shí)際生長(zhǎng)促進(jìn)率HPmix小于計(jì)算生長(zhǎng)促進(jìn)率HPmix-IA,實(shí)際突變促進(jìn)率MP-HCmix大于計(jì)算突變促進(jìn)率MP- HCmix-IA,表示對(duì)的生長(zhǎng)抑制與突變頻率上升起到協(xié)同作用;實(shí)際質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率RP-HCmix小于計(jì)算質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率RP-HCmix-IA,表示對(duì)接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用.三元混合抗生素處于HCmix濃度時(shí),實(shí)際生長(zhǎng)促進(jìn)率HPmix小于計(jì)算生長(zhǎng)促進(jìn)率HPmix-IA,表示對(duì)的生長(zhǎng)抑制起到協(xié)同作用;實(shí)際突變促進(jìn)率MP-HCmix小于計(jì)算突變促進(jìn)率MP-HCmix-IA,實(shí)際質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率RP-HCmix小于計(jì)算質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移促進(jìn)率RP- HCmix-IA,表示對(duì)的突變頻率上升與接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用.上述結(jié)果表明,二元與三元混合抗生素對(duì)細(xì)菌的毒性都增加,但是抗生素種類的增加能夠抑制細(xì)菌耐藥突變與質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生.因此,由上述混合抗生素實(shí)際與計(jì)算的毒性、突變、RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)大小比較,推測(cè)環(huán)境中基于“雞尾酒”暴露體系的混合抗生素(3種或3種以上),會(huì)增加生物的毒性風(fēng)險(xiǎn),但卻能夠降低耐藥性風(fēng)險(xiǎn).發(fā)現(xiàn)同時(shí)包含TC與SAP的三元混合方式較其他三元混合方式具有更明顯的“毒性風(fēng)險(xiǎn)增加、細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)降低”的環(huán)境影響.

本文研究結(jié)果表明,一定程度上增加抗生素混合種類,會(huì)增加毒性風(fēng)險(xiǎn),但卻能夠降低細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn).可能原因在于混合抗生素中抗生素種類的增加,使抗生素作用于更多靶蛋白,這些靶蛋白可能處于同一條信號(hào)通路,使得對(duì)這一通路的抑制性更好,共同抑制細(xì)菌生長(zhǎng),放大抑制效果,增加毒性協(xié)同,從而增加毒性風(fēng)險(xiǎn).由于混合抗生素毒性增強(qiáng),影響細(xì)菌核酸和氨基酸的生成,導(dǎo)致突變所需要的蛋白供給減少,進(jìn)而抑制的突變頻率上升.混合抗生素使細(xì)菌總數(shù)減少,影響供體和受體細(xì)菌的活性,甚至是結(jié)合子的活性,從而使RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移數(shù)減少,抑制的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率上升,減少細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)[33].

此外,本研究還說(shuō)明混合抗生素的毒性風(fēng)險(xiǎn)與細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)似乎無(wú)法同時(shí)降低,毒性風(fēng)險(xiǎn)與細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)降低的目的可能需要通過(guò)新型抗生素的替代使用來(lái)達(dá)到.另一方面,本文發(fā)現(xiàn)即使是在抗生素多重混合使用的情況下,其對(duì)于生長(zhǎng)、耐藥突變與RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用區(qū)間始終存在,這表明環(huán)境中多種抗生素的殘留帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)仍然不可忽視.在今后的研究中,需要關(guān)注環(huán)境中抗生素暴露的濃度和種類,以及抗生素與新型抗生素混合對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)與耐藥性的影響.

3 結(jié)論

3.1 在HCmix時(shí)二元混合雖能夠有效抑制的生長(zhǎng),但卻促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的發(fā)生.

3.2 三元混合對(duì)生長(zhǎng)抑制起到協(xié)同作用,對(duì)耐藥突變頻率上升與接合轉(zhuǎn)移頻率上升起到拮抗作用,其中TCs&SAPs&其他測(cè)試抗生素的三元混合方式具有更明顯的“毒性風(fēng)險(xiǎn)增加、細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)降低”的環(huán)境效應(yīng).

3.3 基于“雞尾酒療法”使用的抗生素在進(jìn)入環(huán)境后,其“雞尾酒”暴露特征可能增加毒性風(fēng)險(xiǎn),降低細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn),但整體上造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視.

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The effects of antibiotic mixtures on bacterial resistance based on “cocktail” exposure.

HAN Bao-cang1, CHEN Zhi-bin1, ZHANG Yue-heng1, LIN Zhi-fen1, SUN Hao-yu2*

(1.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China；2.Key Laboratory of Organic Compound Pollution Control Engineering (MOE), School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University, Shanghai 200444, China)., 2022,42(1)：434～443

Three kinds of commonly used antibiotics, i.e., tetracyclines, sulfonamides, and sulfonamide potentiators, were selected as representatives to obtain their concentration for the hormetic maximum promoting effect on() (HCmax). The binary and ternary mixtures of test antibiotics were designed based on equal HCmaxrations, and their combined effects on bacterial growth and resistance (mutation and plasmid conjugation) ofwere explored. The results showed binary mixtures synergistically inhibited the growth and conjugation frequency, but synergistically stimulated the mutation frequency. The combined effects of ternary mixtures on toxicity and resistance were all synergistic inhibition. Therefore, it could be speculated that binary mixtures might increase the risk of toxicity and resistance, while ternary mixtures might result in an increased toxicity risk but a decreased resistance risk.

antibiotic mixtures；bacterial resistance；hormesis；mutation；conjugation transfer

X171.5

A

1000-6923(2022)01-0434-10

韓寶蒼(1997-),男,山東臨沂人,同濟(jì)大學(xué)博士研究生,主要從事抗生素環(huán)境毒理研究.發(fā)表論文2篇.

2021-06-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(22006116,21777123);博士后創(chuàng)新人才支持計(jì)劃(BX20190247);中國(guó)博士后科學(xué)基金(2019M661624);上?！俺?jí)博士后”激勵(lì)計(jì)劃(2019194)

* 責(zé)任作者, 副研究員, sunhaoyu2021@shu.edu.cn