急性心肌梗死患者血清GRP78、mir-335表達(dá)與心功能關(guān)系

劉晨，程國杰，甘榕榕

急性心肌梗死（AMI）嚴(yán)重威脅人們生命健康，早期診斷對降低死亡率以及改善預(yù)后十分重要[1,2]，生物標(biāo)志物與心電圖相結(jié)合是診斷AMI的主要手段，目前生物標(biāo)志物肌鈣蛋白I（cTnI）常出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此尋找更敏感的生物標(biāo)志物至關(guān)重要[3,4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在心血管疾病中具有調(diào)節(jié)及診斷潛力，可能與其能夠結(jié)合靶基因3'-UTR區(qū)調(diào)節(jié)基因表達(dá)有關(guān)[5]。mir-335作為一種miRNA，其表達(dá)上調(diào)可能顯著抑制心肌梗死大鼠心肌炎癥及心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌損傷[6]。心肌細(xì)胞死亡是由心肌梗死（MI）造成的最嚴(yán)重?fù)p害之一，關(guān)于葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的最新研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心力衰竭（心衰）的大鼠模型GRP78蛋白表達(dá)增加，并參與疾病的發(fā)生[2]。目前關(guān)于二者在AMI中的研究多為細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)，相關(guān)臨床研究較少，本文通過對AMI患者血清GRP78和mir-335表達(dá)與心功能關(guān)系進(jìn)行探究，以期為AMI早期診斷生物標(biāo)志物尋找方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象共納入207例患者，選取2018年1月至2020年4月于首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院心內(nèi)科確診為AMI患者102例作為AMI組，其中男性55例，女性47例，平均年齡57.32±7.98歲；穩(wěn)定型心絞痛（SAP）患者105例為SAP組，其中男性44例，女性37例，平均年齡56.79±6.90歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；無合并甲亢等代謝性疾??；初次確診，符合美國心臟病協(xié)會（AHA）所制定的AMI及SAP診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤患者；冠狀動脈（冠脈）支架植入術(shù)及旁路手術(shù)史患者；免疫系統(tǒng)疾病患者。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者及家屬均知情并簽署同意書。

1.2 主要試劑與儀器反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（貨號：BTN170403-RFS、BTN90408-YNZ）購自北京百奧萊博科技有限公司；總RNA提取試劑盒（貨號：CD-13433-ML）購自武漢純度生物科技有限公司；腦鈉肽（BNP）ELISA檢測試劑盒（貨號：CBLE1347h）購自武漢楚銳科藥業(yè)科技有限公司；GRP78（貨號：YS02906B）購自上海雅吉生物科技有限公司；CFX384? Touch熒光定量PCR系統(tǒng)購自伯樂（Bio-Rad）公司；AU5800全自動分析系統(tǒng)購自美國貝克曼庫爾特有限公司；SPRT2100C全自動酶標(biāo)儀購自德國IFP公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及檢測兩組患者于入院次日抽取空腹靜脈血4 ml，10 min 3000 rpm離心后取上清，置于-20℃冰箱待測；2 ml用于ELISA法檢測肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、cTnI、BNP及GRP78水平；2 ml用于檢測mir-335表達(dá)情況。

1.3.2 超聲心動圖檢查兩組患者在入院12 h內(nèi)均行超聲心動圖，測量左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.3.3 ELISA法檢測各因子水平根據(jù)檢測試劑盒說明書檢測在450 nm處檢測兩組患者血清中CKMB、cTnI、BNP及GRP78的表達(dá)情況。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測mir-335表達(dá)情況RNA提取試劑盒各血清樣本總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板經(jīng)過qRTPCR檢測mir-335在各組血清中的表達(dá)情況。U6分別作為mir-335的內(nèi)參對mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-△△Ct分析其表達(dá)水平，Oligo 7和Primer 3.0軟件設(shè)計如表1所示，引物并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述，SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例表示，采用卡方檢驗(yàn)；mir-335及GRP78表達(dá)與CK-MB、cTnI、BNP及LVEF間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行分析；受試者工作特征（ROC）曲線評估m(xù)ir-335及GRP78表達(dá)水平對AMI的診斷價值；使用Logistic回歸分析影響AMI發(fā)生的因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較兩組在患者年齡、體質(zhì)指數(shù)、性別、高血壓、冠心病、糖尿病史間均無顯著性差異（P＞0.05），表2。

表2 受試患者的一般資料

2.2 兩組CK-MB、cTnI、BNP及LVEF比較與SAP組比較，AMI組患者血清中CK-MB、cTnI、BNP含量顯著增加，LVEF含量顯著降低（P＜0.05），表3。

表3 SAP和AMI組血清中CK-MB、cTnI、BNP含量及LVEF

2.3 兩組GRP78和mir-335 mRNA的表達(dá)情況與SAP組比較，AMI組患者血清中GRP78表達(dá)水平顯著增加，而mir-335表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表4。

表4 SAP組和AMI組血清中GRP78和mir-335 mRNA表達(dá)情況

2.4 AMI組血清中GRP78和mir-335與CK-MB、cTnI、BNP及LVEF的相關(guān)性AMI組患者血清中GRP78與CK-MB、cTnI、BNP均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與LVEF呈顯著負(fù)相關(guān)；mir-335與CK-MB、cTnI、BNP均呈顯著負(fù)相關(guān)，與LVEF呈顯著正相關(guān)關(guān)系，表5。

表5 AMI組血清中GRP78和mir-335與CK-MB、cTnI、BNP及LVEF的相關(guān)性

2.5 AMI組血清中GRP78和mir-335的相關(guān)性通過http://www.targetscan.org/vert_72/預(yù)測顯示GRP78和mir-335間存在結(jié)合位點(diǎn)，GRP78是mir-335的潛在靶基因。如圖1所示，AMI組患者血清中GRP78與mir-335呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.732，P=0.000）。

圖1 AMI組血清中GRP78和mir-335的相關(guān)性

2.6 ROC曲線分析GRP78和mir-335對AMI的診斷價值如圖2所示，GRP78和mir-335評估AMI發(fā)生的曲線下面積（AUC）分別為0.897和0.722，截斷值：1.778、1.183；靈敏度：76.47%、52.00%；特異性：98.10%、91.40%；二者聯(lián)合檢測評估AMI發(fā)生的AUC為0.924，靈敏度：80.40%；特異性：97.10%。

圖2 ROC曲線分析GRP78和mir-335對AMI的診斷價值

2.7 Logistic回歸分析影響AMI發(fā)生的因素AMI患者GRP78和mir-335表達(dá)水平的中位數(shù)分別為1.313和0.872，高于中位數(shù)為高表達(dá)，低于中位數(shù)為低表達(dá)，對二者表達(dá)進(jìn)行Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)GRP78及mir-335表達(dá)均對AMI發(fā)生存在影響（P＜0.05）。多因素分析發(fā)現(xiàn)，GRP78高表達(dá)及mir-335低表達(dá)均是影響AMI發(fā)生的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），表6。

表6 Logistic回歸分析影響AMI發(fā)生的因素

3 討論

AMI是由斑塊潰瘍或血管內(nèi)血栓形成、破裂后所釋放的血栓物質(zhì)引發(fā)的急性冠脈綜合征引起的全球最常見的心臟疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生命健康[8]。雖然AMI診斷金標(biāo)準(zhǔn)cTn有助于疾病診斷，但對于慢性冠脈疾病常出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因此尋找新型敏感性早期診斷生物標(biāo)志物對臨床治療極為重要[9]。

mir-335-5p與心力衰竭的左心室重塑（LVR）有關(guān)[10]。mir-335表達(dá)水平在MI區(qū)域明顯降低，其過表達(dá)可通過靶向抑制促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2）表達(dá)來降低氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、炎癥損傷，從而達(dá)到改善MI大鼠心功能的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，mir-335的上調(diào)可通過靶向低氧誘導(dǎo)因子1-α亞基抑制劑（HIF1AN）改善心肌缺血再灌注損傷（MIRI）[11]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI患者血清中CK-MB、cTnI、BNP含量顯著增加，而LVEF含量和mir-335表達(dá)水平顯著降低，且mir-335與CK-MB、cTnI、BNP均呈顯著負(fù)相關(guān)，而與LVEF呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與之前研究結(jié)果一致。該結(jié)果表明mir-335參與AMI的發(fā)生，且與心肌損傷標(biāo)志物及心功能指標(biāo)密切相關(guān)，有作為疾病早期檢測生物標(biāo)志物的潛能。

大量研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）參與缺血再灌注損傷的發(fā)生，而GRP78是ERS相關(guān)途徑中的關(guān)鍵因子[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)MI模型大鼠心肌組織中GRP78表達(dá)水平顯著增加，前列腺素E1（PGE1）可抑制ERS且伴隨GRP78表達(dá)下降，抑制炎癥反應(yīng)、膠原增生并改善心功能[14]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI患者血清中GRP78表達(dá)水平顯著高于SAP組，與CKMB、cTnI、BNP均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與LVEF呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；該結(jié)果表明GRP78可能參與AMI的發(fā)生，且與CK-MB、cTnI、BNP及LVEF密切相關(guān)，具有一定臨床參考價值。

本研究靶基因預(yù)測結(jié)果顯示GRP78是mir-335的潛在靶基因，二者呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，且二者聯(lián)合評估AMI的靈敏度更高；此外，多因素分析發(fā)現(xiàn)，GRP78高表達(dá)及mir-335低表達(dá)均是影響AMI發(fā)生的獨(dú)立危險因素。結(jié)果表明，mir-335參與AMI的發(fā)生可能與其負(fù)調(diào)控GRP78有關(guān)，二者聯(lián)合評估AMI的診斷價值更高，可作為AMI早期診斷標(biāo)志物。

綜上所述，AMI患者血清中GRP78和mir-335表達(dá)水平與心功能密切相關(guān)，二者有作為疾病早期診斷指標(biāo)的潛能。因樣本量限制，可能存在統(tǒng)計學(xué)差異，今后研究中應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。