大刺鰍人工繁殖與胚胎發(fā)育研究

方 園，吳 真，曾慶祥*，劉 斌，鐘穎良，王海華，彭進(jìn)榕，黃雅貞，郭 婧

(1.贛州市水產(chǎn)研究所，江西 贛州 341100；2.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；3.廣州市河盛匯農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司，廣東 廣州 511300)

大刺鰍(Mastacembelusarmatus)屬于鱸形目(Perciformes)、刺鰍科(Mastacembelidae)、刺鰍屬(Mastacembelus)魚類[1]，主要分布在長(zhǎng)江流域以及南方水系中[2]。大刺鰍的肌肉蛋白含量高、氨基酸種類豐富，既有較好的美食口感，也有較高的營養(yǎng)價(jià)值[3]。由于大刺鰍野生資源稀少、人工養(yǎng)殖量小，目前，其市場(chǎng)價(jià)格高達(dá)200元/kg。特別是近年來，部分地區(qū)由于過度非法捕撈以及水域生態(tài)環(huán)境的惡化，我國野生大刺鰍的資源量呈現(xiàn)日益減少的趨勢(shì)，因此，發(fā)展大刺鰍人工增養(yǎng)殖勢(shì)在必行。

目前，國內(nèi)針對(duì)大刺鰍人工繁殖和胚胎發(fā)育特征觀察的研究只有少量報(bào)道[4-7]。本課題組近年來已經(jīng)在大刺鰍池塘養(yǎng)殖、生物學(xué)特性、人工繁殖、仿生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)、常見病防治技術(shù)等方面開展了相關(guān)的試驗(yàn)研究[8-12]，但在人工繁殖和胚胎發(fā)育方面尚未進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步了解大刺鰍繁殖特征，突破大刺鰍規(guī)?；咝Х敝臣夹g(shù)，掌握大刺鰍胚胎發(fā)育情況。筆者于2020年進(jìn)行了3批次大刺鰍人工繁殖試驗(yàn)，并觀察其胚胎發(fā)育特征。

1 材料與方法

1.1 繁殖前期準(zhǔn)備

1.1.1 親本魚的培育與選擇 開春后，水溫穩(wěn)定在18 ℃以上時(shí)，開始投喂全價(jià)配合飼料，選擇正規(guī)廠家生產(chǎn)的大刺鰍專用飼料，其粗蛋白含量47%以上，并在飼料中適量添加維生素E。隨著水溫的升高，逐步增加飼料投喂量，直至每天投喂量穩(wěn)定在大刺鰍體重的6%左右。在人工繁殖前2周，適當(dāng)減少配合飼料投喂量，以減少雌魚體內(nèi)脂肪積累，保證卵子質(zhì)量。

選用池塘養(yǎng)殖的3冬齡以上大刺鰍作親本，要求雌魚體重150 g以上、雄魚體重200 g以上。根據(jù)曾慶祥等[13]挑選方法，選擇腹部黃白色、膨大柔軟圓潤、生殖孔凸起紅潤、個(gè)體略顯粗短的雌性大刺鰍作母本，腹部皮膚灰黑、沒有明顯膨大、游動(dòng)較激烈、個(gè)體粗長(zhǎng)的雄性大刺鰍作為父本。雌雄比為5∶1。

將挑選好的大刺鰍親魚暫養(yǎng)在面積約20 m2且已經(jīng)消毒好的水泥池中，消毒藥物選擇聚維酮碘溶液，按0.25 g/m3(有效碘10%)的劑量全池潑灑，暫養(yǎng)池要求池底及池壁光滑，最好貼有瓷磚，保持水深50 cm，進(jìn)(排)水方便，進(jìn)水管與池邊呈45°～60°夾角，使水流呈噴射狀沖擊水面，確保池水呈現(xiàn)循環(huán)流動(dòng)狀態(tài)，同時(shí)開啟增氧機(jī)，保證池內(nèi)水體中有充足的溶解氧。

1.1.2 孵化池準(zhǔn)備 孵化池的構(gòu)造與親本暫養(yǎng)池基本一致，先用水沖洗去除池中雜物后，使水位保持在50 cm，用10 g/m3高錳酸鉀溶液對(duì)孵化池浸泡消毒，30 min后將水排干；用清水沖洗完后將水位保持在40 cm，開啟增氧機(jī)，保證水體溶氧充足。開啟加熱棒，將加熱棒溫度設(shè)置為28 ℃，在池底放置溫度計(jì)，便于觀測(cè)和記錄水溫。

1.2 人工催產(chǎn)與授精

1.2.1 人工催產(chǎn) 采用背部肌肉注射法，分2次注射。催產(chǎn)藥物及劑量為：1000 IU/kg絨毛膜促性腺激素(HCG)、10 μg/kg促黃體素釋放激素A2(LRH-A2)和5 mg/kg地歐酮(DOM)，將3種催產(chǎn)素放入燒杯中混合均勻后待用。雌魚第1次按1 mL/kg體重的量注射，約12 h后注射第2次，第2次注射量減半，注射后將水溫加溫至29～30 ℃。雄魚不注射催產(chǎn)素。

1.2.2 人工授精 采用濕法授精，具體步驟：使用適量魚安定將大刺鰍親魚麻醉，用毛巾將雌性親魚魚體上的水分擦拭后擠卵，從腹部前端往生殖孔方向?qū)⒙炎訑D于消毒好的不銹鋼盆中。雄性親魚擠精方法類似，再利用注射器吸取擠出的精子，注入裝有生理鹽水的不銹鋼盆中，混勻后倒入放有卵子的不銹鋼盆中，并用另一個(gè)不銹鋼盆反復(fù)傾倒以充分混勻，完成授精，最后將受精卵均勻倒入準(zhǔn)備好的孵化器、孵化池中進(jìn)行孵化。孵化過程中水溫保持在28～29 ℃之間，孵化池水體的溶解氧應(yīng)始終保持在5 mg/L以上，池水pH值在7.2～7.8之間。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

人工授精后，立即取少量受精卵均勻地鋪于培養(yǎng)皿中，在Olympus顯微鏡下觀察，并用數(shù)碼攝像系統(tǒng)拍照，詳細(xì)記錄各時(shí)期的發(fā)育特征和時(shí)間，以50%以上胚胎達(dá)到某期確定為該發(fā)育過程的起始時(shí)間，從前一個(gè)發(fā)育階段到下一個(gè)發(fā)育階段之間的時(shí)間間隔為該階段的發(fā)育期間，并通過隨機(jī)觀察記錄3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行重復(fù)觀察驗(yàn)證。

在卵裂期時(shí)，每15 min觀察1次胚胎發(fā)育情況，進(jìn)入囊胚期后每30 min觀察1次胚胎發(fā)育情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

(1)胚胎發(fā)育各階段的積溫(℃·h)=此階段胚胎發(fā)育時(shí)間(h)×水溫(℃)[14]。

(2)催產(chǎn)率(%)=注射催產(chǎn)素后成功擠出卵子的樣本數(shù)/總樣本數(shù)×100%。

(3)胚胎發(fā)育到原腸中期時(shí)統(tǒng)計(jì)受精卵數(shù)和總樣本卵數(shù)，受精率(%)=受精卵數(shù)/樣本卵數(shù)×100%。

(4)孵化率(%)=出苗數(shù)/樣本受精卵數(shù)×100%。

(5)游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量卵徑大小、仔魚全長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工繁殖情況

分別于5月28日、5月30日、6月1日對(duì)大刺鰍進(jìn)行人工催產(chǎn)繁殖，具體情況見表1。挑選的大刺鰍雌魚體長(zhǎng)(32.3±0.05)cm，雄魚體長(zhǎng)(44.1±0.05)cm。催產(chǎn)后約10 h，池底有卵子出現(xiàn)后，開始進(jìn)行人工擠卵。擠出的大刺鰍卵子大部分為成熟卵，呈橙黃色，有少許白色，卵徑(1.94±0.05)mm，沉性卵，具黏性(圖1-a)。3次人工催產(chǎn)獲得的卵重平均約200粒/g，雌性親本平均懷卵量約3036粒/尾，催產(chǎn)率平均為99.20%，受精率平均為82.77%，孵化率平均為77.20%。

表1 人工催產(chǎn)情況

2.2 胚胎發(fā)育過程

在28～29 ℃水溫條件下，大刺鰍胚胎發(fā)育過程從受精卵到孵出仔魚歷時(shí)約50.5 h，主要經(jīng)過受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞、多細(xì)胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原腸胚期(原腸早期、原腸中期、原腸晚期)、神經(jīng)胚期(神經(jīng)胚期、胚孔封閉期)、器官形成期(肌節(jié)出現(xiàn)期、視泡期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期、心跳期)、出膜期等8個(gè)階段共22個(gè)時(shí)期。根據(jù)胚胎發(fā)育各階段的發(fā)育時(shí)間與水溫關(guān)系，得到整個(gè)胚胎發(fā)育過程總積溫約1454.4 ℃·h。各發(fā)育時(shí)期主要特征見表2。

表2 大刺鰍的胚胎發(fā)育

2.2.1 受精卵 大刺鰍的成熟卵子受精后吸水膨脹，卵徑(2.15±0.05)mm。大約10 min后，形成受精卵，受精卵呈卵圓形，色澤為金黃色或者橘黃色，極性不明顯，在受精卵內(nèi)部出現(xiàn)多個(gè)大小不等的油球(圖1-b)，油球數(shù)隨著受精卵的發(fā)育而逐漸減少，最后形成少量且較大的油球。

2.2.2 胚胎隆起 受精大約0.6 h后，胚胎中細(xì)胞質(zhì)向動(dòng)物極方向集中，并向上隆起，形成帽狀的胚盤(圖1-c)。

2.2.3 卵裂期 大刺鰍受精卵卵裂只分布在動(dòng)物極部分，是典型的不完全卵裂方式。受精后1.2 h，受精卵開始分裂，形成2個(gè)大小相等形狀相近的細(xì)胞球(圖1-d)。受精1.8 h后，出現(xiàn)第2次分裂，該分裂與第1次分裂方向垂直，形成4個(gè)大小相近的細(xì)胞球，該時(shí)期為4細(xì)胞期(圖1-e)。受精后3 h，胚胎開始第3次分裂，形成體積較小的8個(gè)分裂球(圖1-f)。受精后3.4 h，胚盤開始第4分裂，形成16個(gè)小分裂球，該時(shí)期為16細(xì)胞期(圖1-g)。受精后4.6 h，胚盤分列出多個(gè)分裂球，為多細(xì)胞期(圖1-h)。受精后7.0 h，胚盤繼續(xù)分裂成桑葚狀，為桑葚期(圖1-i)。

2.2.4 囊胚期 受精后8.2 h，由于胚盤持續(xù)分裂，許多個(gè)分裂細(xì)胞緊密粘接，顯微鏡下難以看出細(xì)胞間隙，形成囊胚狀突起結(jié)構(gòu)，此時(shí)為囊胚早期(圖1-j)。受精后8.7 h，囊狀突起高度降低，呈下包趨勢(shì)覆蓋在卵黃表面，此時(shí)為囊胚中期(圖1-k)。受精后9.6 h，囊狀突起呈明顯下包狀態(tài)，囊胚層變扁平，即囊胚晚期(圖1-l)。

2.2.5 原腸胚期 受精后13.2 h，囊胚層繼續(xù)下包至1/2處，胚層邊緣細(xì)胞集中形成胚環(huán)結(jié)構(gòu)，此時(shí)為原腸胚早期(圖1-m)。受精后16.4 h，下包至2/3處，胚盾出現(xiàn)，進(jìn)入原腸胚中期(圖1-n)。受精后21.8 h，下包至3/4，胚盾延長(zhǎng)，形成胚孔結(jié)構(gòu)，此時(shí)為原腸晚期(圖1-o)。

2.2.6 神經(jīng)胚期 受精后25.5 h，胚盤繼續(xù)下包至4/5，未包被的卵黃形成栓狀結(jié)構(gòu)，即卵黃栓。胚盾繼續(xù)延長(zhǎng)，形成神經(jīng)板。此時(shí)為神經(jīng)胚期(圖1-p)。受精后29.8 h，進(jìn)入胚孔封閉期(圖1-q)。

2.2.7 器官形成期 受精后32.5 h，胚體中部出現(xiàn)肌節(jié)，此時(shí)為肌節(jié)出現(xiàn)期(圖1-r)。受精后33.8 h，進(jìn)入視泡期，這時(shí)胚體中出現(xiàn)橢圓形黑點(diǎn)(圖1-s)。受精后35.6 h，尾節(jié)呈芽狀出現(xiàn)，此時(shí)為尾芽期(圖1-t)。受精后37.7 h，配體出現(xiàn)顫動(dòng)，此時(shí)為肌肉效應(yīng)期(圖1-u)。受精后40.9 h，胚體中出現(xiàn)明顯的類似管狀心臟，微弱顫動(dòng)，即進(jìn)入心跳期(圖1-v)。

2.2.8 出膜期 受精后50.5 h，胚體變長(zhǎng)，形成橢圓形，尾巴破膜伸出。剛出膜的仔魚肉眼看除2個(gè)黑色眼囊外全身透明，仔魚全長(zhǎng)平均(6.52±0.05)mm，卵黃囊寬(1.38±0.05)mm、長(zhǎng)(2.72±0.05)mm。顯微鏡下仔魚嘴巴會(huì)進(jìn)行緩慢咬合，心跳有規(guī)律，全身紅色血管流動(dòng)清晰(圖1-w)。

a.成熟卵子；b.受精卵；c.胚胎隆起；d.2細(xì)胞期；e.4細(xì)胞期；f.8細(xì)胞期；g.16細(xì)胞期；h.多細(xì)胞期；i.桑葚期；j.囊胚早期；k.囊胚中期；l.囊胚晚期；m.原腸早期；n.原腸中期；o.原腸晚期；p.神經(jīng)胚期；q.胚孔封閉期；r.肌節(jié)出現(xiàn)期；s.視泡期；t.尾芽期；u.肌肉效應(yīng)期；v.心跳期；w.出膜期

3 討論

3.1 大刺鰍的人工繁殖

對(duì)于魚類催產(chǎn)激素的使用，目前廣泛使用的有HCG、LRH-A2、DOM、PG等激素。在激素使用比較研究中發(fā)現(xiàn)，魚類對(duì)HCG、LRH-A2、DOM這3種激素的混合使用敏感度最高，催產(chǎn)率和孵化率都顯著優(yōu)于單一激素或其他組合。針對(duì)大刺鰍人工繁殖技術(shù)，目前的研究也發(fā)現(xiàn)混合使用HCG、LRH-A2、DOM這3種催產(chǎn)激素的催產(chǎn)效果最好[15]。同樣，本研究嘗試通過2次注射HCG、LRH-A2和DOM混合物，觀察大刺鰍的產(chǎn)卵效率，結(jié)果顯示：催產(chǎn)效率明顯上升，催產(chǎn)后約10 h后即可擠出較為成熟的卵子，產(chǎn)卵量約3036粒/尾，表明通過2次激素刺激能提升大刺鰍的產(chǎn)卵效率。

另外，為初步探索大刺鰍催產(chǎn)的最高溫度，筆者將大刺鰍在29～30 ℃的催產(chǎn)溫度下進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大刺鰍亦能有效催產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，大刺鰍繁殖時(shí)間主要是在春夏季節(jié)的4～7月[16]，但是在8月底、9月初的水溫較高時(shí)，大刺鰍仍會(huì)高效產(chǎn)卵[17]。這說明相對(duì)于四大家魚，大刺鰍親本的產(chǎn)卵溫度范圍較廣，具備適當(dāng)?shù)挚弓h(huán)境惡化的能力。

催產(chǎn)出的大刺鰍成熟卵子呈橙黃色、易沉底，具有弱黏性，但隨時(shí)間的推移，其黏性會(huì)降低。大刺鰍卵徑(1.94±0.05)mm，這與薛凌展[7]和李曉雙[6]等的研究結(jié)果基本一致。卵重平均200粒/g，雌性親本平均懷卵量約3036粒/尾，這與劉霆[18]和周惠強(qiáng)[19]等調(diào)查的大刺鰍懷卵量相近。

3.2 大刺鰍的胚胎發(fā)育

本研究通過在28～29 ℃水溫條件下，培養(yǎng)觀察大刺鰍胚胎發(fā)育情況，將大刺鰍胚胎發(fā)育過程區(qū)分為受精卵、胚胎隆起、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、出膜期等8個(gè)階段22個(gè)時(shí)期，符合“卵裂-胚體形成-器官分化-孵化出膜”的發(fā)育順序。

水溫是魚類胚胎發(fā)育時(shí)間的重要影響因子[20]，并且在適當(dāng)?shù)臏囟确秶趸逝c溫度呈正相關(guān)[21-22]。薛凌展[7]研究提出：在(25±1)℃的孵化條件下，大刺鰍受精卵歷時(shí)65 h孵化出膜，而本試驗(yàn)中大刺鰍的胚胎在28～29 ℃水溫下發(fā)育時(shí)間約52 h，減少了約13 h，這為大刺鰍規(guī)?；绶N繁殖節(jié)約了時(shí)間，提高了孵化效率，且孵化率達(dá)77.20%，說明大刺鰍胚胎發(fā)育在28～29 ℃溫度下的孵化效率較高，28～29 ℃是大刺鰍胚胎發(fā)育的適宜溫度。另外，筆者發(fā)現(xiàn)大刺鰍胚胎發(fā)育總積溫約1454.4 ℃·h，該結(jié)果略低于薛凌展[7]的研究(1624.5±58.12)℃·h，這可能與孵化溫度的升高有關(guān)。本研究詳細(xì)記錄了28～29 ℃環(huán)境下大刺鰍胚胎發(fā)育各階段的主要特征及發(fā)育時(shí)間，為今后深入開展大刺鰍的生物學(xué)、胚胎學(xué)等研究提供了重要的參考資料。另外，本研究提出的大刺鰍人工繁殖技術(shù)，可在生產(chǎn)上指導(dǎo)大刺鰍規(guī)?；咝Х敝?，加快大刺鰍產(chǎn)業(yè)發(fā)展的進(jìn)程，增加漁民的養(yǎng)殖收入，促進(jìn)特色高效水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。