中藥抗菌劑對費氏弧菌的單一及聯(lián)合毒性效應

徐怡婷，孫昊宇，林志芬，印春生,*

1. 上海海洋大學海洋生態(tài)與環(huán)境學院，上海 201306 2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環(huán)境科學與工程學院，上海 200092

近年來，隨著抗生素的廣泛以及不合理使用，環(huán)境中產(chǎn)生了大量的耐藥菌。目前，臨床中耐藥菌的檢出率有逐年增加的趨勢，更有研究報道了超級耐藥細菌的出現(xiàn)[1]，這可能導致抗生素在治療感染性疾病時的藥效降低甚至完全失效，對人類的健康構成了極大威脅。因此，研究人員試圖尋求新的抗菌藥物來替代傳統(tǒng)的抗生素類藥物，以緩解目前抗生素大量使用導致的細菌耐藥性問題。

中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，具有資源豐富、價格低廉、成分復雜、作用靶點多、抗菌譜廣、安全性高和毒副作用小的特點。例如，Peng等[2]發(fā)現(xiàn)小檗堿對無乳鏈球菌具有抑制作用，且最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)為78 g·mL-1，初步的機制研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可能通過破壞細菌的細胞膜結構和抑制蛋白質(zhì)與DNA的合成，最終導致無乳鏈球菌死亡。Chinnam等[3]研究發(fā)現(xiàn)黃岑素對大腸桿菌具有較強的抑菌作用，其抑制作用的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約為0.29 mmol·L-1。此外，有研究表明細菌對中藥不易產(chǎn)生耐藥性[4-5]。因此，以中藥為母體，從中藥材中提取有效的、環(huán)境友好的抗菌藥物，將可能是一種緩解目前細菌耐藥性污染的新途徑。

目前，從中藥中提取的具有抗菌活性的成分可以被稱為中藥抗菌劑，主要有蒽醌類、萜類、生物堿類、黃酮類、有機酸類、揮發(fā)油類、糖類和皂苷類等物質(zhì)[6]。其中，蒽醌類和萜類化合物在自然界分布廣泛，是許多中草藥的重要組成部分。此外，蒽醌類化合物因其分子內(nèi)含有蒽醌結構，能夠抑制細菌的呼吸代謝、破壞細菌的細胞壁和細胞膜、抑制蛋白合成及作用于遺傳物質(zhì)、干預細菌生物膜形成過程、抗內(nèi)毒素，從而對多種細菌表現(xiàn)出抑制作用[7]。大黃素(emodin, EMO)是一種存在于大黃、何首烏、決明子和虎杖等多種中藥材中的羥基蒽醌類衍生物。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)EMO具有廣譜抑菌作用，對白喉、枯草、副傷寒、流感桿菌及肺炎球菌和卡他球菌有效，且對厭氧菌有很強的抑制作用，同時金黃色葡萄球菌對其不易產(chǎn)生耐藥性，鏈球菌亦對其敏感[8]。大黃酸(rhein, RH)是大黃的主要有效成分之一，亦為蒽醌類衍生物，其藥理作用廣泛。近年來，有諸多研究表明RH具有很好的抑菌效果。例如，Azelmat等[9]研究發(fā)現(xiàn)RH對牙齦卟啉單胞菌具有較強的抑制作用，其MIC為2.5 μg·mL-1。蘆薈大黃素(aloe-emodin, AE)是從蘆薈、大黃及決明子等傳統(tǒng)中藥中提取的一種蒽醌類生物活性成分，對大腸埃希菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、幽門螺旋桿菌及結核分枝桿菌等表現(xiàn)出明顯的抗菌活性[10]。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是青蒿素經(jīng)硼氫化鈉還原得到的衍生物，屬于萜類化合物，其抗菌效應的報道多集中于對抗生素的增強作用上。例如，Li等[11]發(fā)現(xiàn)DHA與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用時，可以通過作用于大腸桿菌的藥物外排泵AcrB而增加β-內(nèi)酰胺類抗生素在細菌體內(nèi)的蓄積，達到協(xié)同抗菌作用。

抗菌劑往往被聯(lián)合使用以起到提高抗菌效果的目的。例如，任皓等[12]測定了鹽酸金霉素、吉他霉素、鹽霉素和黃霉素對明亮發(fā)光桿菌的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)吉他霉素與鹽酸金霉素、鹽霉素和黃霉素的二元組合對細菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)出較強的協(xié)同作用。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)磺胺、磺胺增效劑和四環(huán)素的三元混合物對費氏弧菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌這3種細菌都呈現(xiàn)出協(xié)同效應。那么，中藥抗菌劑的聯(lián)合毒性效應如何？其聯(lián)合毒性作用又會呈現(xiàn)出怎樣的形式呢？這個問題對未來中藥抗菌劑應用后的生態(tài)風險研究具有重要意義，但目前還鮮有報道。

本文以費氏弧菌(Aliivibriofischeri,A.fischeri)作為模式生物，由于費氏弧菌發(fā)光敏感的特點，以其生物熒光作為測試終點，以研究已證明具有抑菌性能的EMO、RH、AE和DHA作為中藥抗菌劑的代表，通過快速、有效和簡便的急性毒性試驗[14]測定了它們對A.fischeri生物熒光的單一和多元聯(lián)合毒性效應，同時進行了抑菌作用機理的初步討論，不僅有利于更全面和深入地認識中藥抗菌劑聯(lián)合暴露對細菌的影響，為今后中藥抗菌劑使用后的生態(tài)風險評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和生物

實驗所用EMO、RH和AE均購自上海麥克林生化科技有限公司(上海，中國)，DHA購自上海源葉生物科技有限公司(上海，中國)，具體信息如表1所示。進行毒性測試所用化合物配制使用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，DMSO為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海，中國)，體系中DMSO的終濃度控制在總體積的0.5%(V/V)以下，以減少DMSO對細菌的影響。EMO、RH、AE和DHA這4種化合物因為溶解度有限，配制的最大母液濃度分別是1.92×10-5、1.23×10-5、9.55×10-5和2.23×10-4mol·L-1。本實驗模式生物費氏弧菌A.fischeri(ATCC 7744)凍干粉購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，馬納薩斯，維吉尼亞州，美國)。

1.2 菌液配制

在無菌操作臺中，從第3代菌株斜面上取一接種環(huán)大小的菌種接入5 mL的液體培養(yǎng)基中，在22 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h至對數(shù)生長期成為搖瓶菌液。取對數(shù)生長期搖瓶菌液加入到2% NaCl溶液中，磁力攪拌40 min，調(diào)整細菌生物熒光的光值(相對光度單位, relative light units, RLU)至75 000～80 000，即可將制成的工作菌液用于毒性測定。

1.3 毒性試驗

受試中藥提取抑菌劑對A.fischeri的毒性實驗在Luminoskan Ascent發(fā)光分析儀(賽默飛世爾科技有限公司，美國)上使用非透明96孔板以生物熒光作為測試終點進行，具體步驟如下：取受試化合物用適量DMSO配制成濃度較高的標準溶液，再用2% NaCl稀釋成等對數(shù)濃度梯度系列。將化合物溶液加入96孔板中，每孔包含160 μL的受試化合物(作為實驗組)或2%的NaCl溶液(作為對照組)和40 μL準備好的菌液。振蕩均勻靜置15 min后測定孔的RLU值。每個濃度點至少3個平行樣。然后，以化合物濃度的對數(shù)為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制劑量-效應曲線(concentration-response curve, CRC)。由于DHA在實驗最大溶解度條件下，抑制率達不到50%，故根據(jù)單一化合物的抑制率達到40%時對應的化合物濃度(EC40)，分別配制等毒性比的二元、三元、四元混合溶液[15]，然后按照單一毒性測定方法測定系列混合溶液的聯(lián)合毒性，再繪制相應的CRC。化合物毒性用其對A.fischeri生物熒光的抑制率表述[16]，如式(1)所示：

表1 實驗藥品信息Table 1 Experimental drug information

(1)

式中：x0代表對照組的RLU值，x代表實驗組的RLU值。

1.4 獨立作用(IA)模型判別聯(lián)合毒性作用

加和作用(concentration action, CA)和獨立作用(independent action, IA)模型近年來經(jīng)常用于混合污染物的聯(lián)合毒性評價。然而，由于CA模型預測時可能存在某些預測盲區(qū)[17]，即需要保證混合物中的各個組分單獨存在時效應濃度能夠?qū)虼丝紤]到某些藥物在低濃度時可能存在Hormesis效應，中藥抗菌劑混合物的聯(lián)合毒性作用使用IA模型進行判別。IA是一種基于混合物組分具有不同作用模式的假設而被廣泛用來評價聯(lián)合毒性的參考模型[18]。其計算公式為：

(2)

式中：cmix和E(cmix)代表混合物的總濃度和總效應；E(ci)代表組分i在混合物中對應ci濃度時的單一效應。IA曲線的統(tǒng)計學不確定性以95%置信區(qū)間表示?；旌衔锏穆?lián)合毒性作用通過比較實際的CRC和IA曲線進行判別[19]：(1)實際的CRC在IA曲線(包含95%置信區(qū)間)的下方，此時混合物聯(lián)合毒性呈現(xiàn)拮抗作用；(2)實際的CRC位于IA曲線(包含95%置信區(qū)間)的中間，此時混合物聯(lián)合毒性呈現(xiàn)相加作用；(3)實際的CRC在IA曲線(包含95%置信區(qū)間)的上方，此時混合物聯(lián)合毒性呈現(xiàn)協(xié)同作用。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 中藥抗菌劑對A. fischeri的單一毒性

EMO、RH、AE和DHA對A.fischeri的單一毒性的結果如圖1所示。通過擬合劑量-效應曲線獲得了EC40，來表征各中藥抗菌劑對A.fischeri的毒性。EMO、RH、AE和DHA的EC40分別為6.39×10-7、2.37×10-6、1.74×10-5和1.25×10-4mol·L-1?？梢钥闯?，EMO的EC40最小，毒性最大，而DHA的EC40最大，毒性最??；受試中藥提取抑菌劑的毒性順序為：EMO>RH>AE>DHA。在之前的研究中，Wu等[20]發(fā)現(xiàn)藥用大黃中幾種羥基蒽醌化合物的抑菌效果為：RH>EMO>AE。該研究與本文實驗結果的差異可能源于模式生物和測試終點的不同：Wu等[20]使用的模式生物是金黃色葡萄球菌，測試終點是金黃色葡萄球菌的生長量；而本文以A.fischeri作為模式生物，測試終點是A.fischeri的生物熒光發(fā)光值。

圖1 中藥提取抑菌劑(TCM)對A. fischeri的單一毒性Fig. 1 The single toxicity of traditional Chinese medicine (TCM) antibacterials to A. fischeri

A.fischeri的生物熒光來源于以下兩步酶促反應[21-23]：

NADH+H++FMN→NAD++FMNH2

(3)

FMNH2+RCHO+O2→FMN+H2O+ RCOOH+light (490 nm)

(4)

式中：NADH表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)MN表示黃素單核苷酸，NAD+表示氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)MNH2表示還原型黃素單核苷酸，RCHO表示醛，RCOOH表示羧酸；反應(3)由NADH/FMN氧化還原酶催化，而反應(4)由熒光素酶催化。

已有研究表明，蒽醌化合物EMO對NADH氧化酶和NADH脫氫酶均有較強的抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的增加而增強；而蒽醌化合物RH、AE對NADH氧化酶的抑制作用不明顯，對NADH脫氫酶有一定的抑制作用，且AE對NADH脫氫酶的抑制程度比RH弱[24]。那么，EMO、RH和AE是如何抑制NADH氧化酶或NADH脫氫酶的活性的呢？從EMO、RH和AE的結構可以看出這3種中藥抗菌劑均屬于羥基蒽醌類化合物。已有研究表明，羥基蒽醌類藥物易與功能蛋白通過氫鍵形成穩(wěn)定的復合物，從而阻斷功能蛋白的生物學作用[25-26]。因此，我們推測EMO與NADH氧化酶以及NADH脫氫酶結合形成穩(wěn)定復合物，RH和AE與NADH脫氫酶結合形成穩(wěn)定復合物，抑制了NADH氧化酶或NADH脫氫酶的活性，從而阻斷線粒體呼吸鏈電子傳遞，影響組織細胞生命活動所需能源的供應，最終抑制發(fā)光反應表現(xiàn)出毒性作用。有研究發(fā)現(xiàn)青蒿素能夠通過抑制NADH脫氫酶而影響線粒體膜的正常功能[27]，因此推測DHA也是通過與NADH脫氫酶相互作用來抑制生物熒光。但由于DHA不具有羥基蒽醌結構，因此可能無法像EMO、RH和AE那樣通過氫鍵形成穩(wěn)定的復合物，從而表現(xiàn)出其對A.fischeri的毒性比EMO、RH和AE小。綜上，推測受試中藥抗菌劑EMO、RH、AE和DHA對A.fischeri生物熒光的抑制作用機制如圖2所示。

2.2 中藥抗菌劑對A. fischeri的聯(lián)合毒性

根據(jù)單一毒性數(shù)據(jù)計算擬合出IA曲線，同時測定了EMO、RH、AE和DHA對A.fischeri生物熒光的多元聯(lián)合毒性并擬合出相應的CRC，以判別各混合體系的聯(lián)合毒性作用。

由圖3可知，在實驗最大溶解度條件下，EMO-RH的最高抑制率最大，高達94.55%，RH-AE次之，最高抑制率為62.03%，而其余4種中藥抗菌劑的二元混合物的最高抑制率均未達到50%，其中AE-DHA的最高抑制率最小，為31.44%。

EMO、RH、AE和DHA的二元混合物的聯(lián)合毒性作用模式結果如表2所示。由圖3和表2可知，EMO-RH、EMO-DHA均呈現(xiàn)明顯的拮抗作用，而EMO-AE、RH-AE、RH-DHA以及AE-DHA二元混合物實際的CRC與IA曲線發(fā)生了交叉，表現(xiàn)為聯(lián)合作用模式隨混合物濃度發(fā)生變化。其中，AE-DHA展現(xiàn)出了低濃度協(xié)同、中濃度相加和高濃度拮抗的聯(lián)合作用模式，而EMO-AE、RH-AE以及RH-DHA在低濃度區(qū)呈相加作用，在高濃度區(qū)呈拮抗作用。

由上可見，在對A.fischeri的生物熒光產(chǎn)生抑制作用的高濃度區(qū)間內(nèi)，4種中藥抗菌劑的二元混合物的聯(lián)合毒性作用模式均為拮抗。如圖2所示，推測可能是在高濃度區(qū)，EMO、RH、AE和DHA以等毒性比二元混合時，化合物之間互相競爭性地對NADH脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，導致對發(fā)光反應的抑制作用減弱，最終導致聯(lián)合毒性降低，表現(xiàn)出拮抗的聯(lián)合毒性作用模式。

根據(jù)圖4可知，比較4種中藥抗菌劑的三元混合物的聯(lián)合毒性效應發(fā)現(xiàn)，在實驗最大溶解度條件下，EMO-RH-AE的毒性最強，最高抑制率達52.17%，EMO-RH-DHA的毒性較弱，最高抑制率為22.58%，而EMO-AE-DHA、RH-AE-DHA對A.fischeri無毒性作用。此外，三元混合物實際的CRC與IA曲線均發(fā)生了交叉。其中，除了RH-AE-DHA展現(xiàn)出了隨混合物濃度升高依次相加、協(xié)同、相加、拮抗的聯(lián)合作用模式，其余三元混合物均在低濃度區(qū)呈相加作用，在高濃度區(qū)呈拮抗作用。同時，通過觀察圖3和圖4發(fā)現(xiàn)，在EMO-RH、EMO-AE、RH-AE二元混合的基礎上加入DHA，對A.fischeri的聯(lián)合毒性作用明顯減弱。如圖2所示，推測可能是EMO、RH、AE和DHA三元混合時，競爭關系更為激烈，對NADH脫氫酶的抑制作用大大減弱，最終導致對發(fā)光反應的抑制作用急劇減弱，聯(lián)合毒性大大降低。

圖2 中藥抗菌劑對A. fischeri的毒性作用機制假設圖注：NADH表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)MN表示黃素單核苷酸，NAD+表示氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，F(xiàn)MNH2 表示還原型黃素單核苷酸，RCHO表示醛，RCOOH表示羧酸；表示中藥抗菌劑對酶的抑制作用，越多表示抑制作用越大。Fig. 2 The hypothesis of toxic mechanism of TCM antibacterials on A. fischeriNote: NADH represents reduced nicotinamide adenine dinucleotide; FMN represents flavin mononucleotide; NAD+ represents oxidized nicotinamide adenine dinucleotide; FMNH2 represents reduced flavin mononucleotide; RCHO represents aldehyde; RCOOH represents carboxylic acid; stands for the inhibition of enzyme by TCM antibacterials and the more “” means the greater the inhibition.

表2 等毒性比組成的二元混合物聯(lián)合毒性Table 2 Joint toxicity of binary mixture in the equal toxic ratio

圖3 中藥抗菌劑的二元混合物的劑量-效應曲線(CRCs)與獨立作用(IA)曲線(包含95%置信區(qū)間)注：── 表示中藥抗菌劑的二元混合物的CRCs；──表示中藥抗菌劑的二元混合物的IA曲線；┅┅表示IA曲線的95%置信區(qū)間。Fig. 3 The concentration-response curves (CRCs) and the independent action (IA) curves with 95% confidence bands for the binary mixture of TCM antibacterialsNote: ── shows the CRCs for the binary mixture of TCM antibacterials; ── shows the IA curves for the binary mixture of TCM antibacterials; ┅┅ shows the 95% confidence bands of IA curves.

由圖5可知，在實驗最大溶解度條件下，EMO-RH-AE-DHA對A.fischeri幾乎無毒性作用。4種化合物的四元混合物實際的CRC與IA曲線同樣發(fā)生了交叉，展現(xiàn)出了在低濃度區(qū)呈相加作用，在高濃度區(qū)呈拮抗作用。通過觀察圖4和圖5發(fā)現(xiàn)，在EMO-RH-AE三元混合的基礎上加入DHA，對A.fischeri的聯(lián)合毒性作用急劇減弱，可能原因是在實驗最大溶解度條件下，這4種中藥抗菌劑聯(lián)合暴露時，它們會競爭性地對NADH脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，這種競爭關系很強，最終導致對發(fā)光反應幾乎不產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合毒性大大降低。

綜上，本文分別測定了EMO、RH、AE和DHA這4種中藥抗菌劑對A.fischeri生物熒光的單一和多元聯(lián)合毒性，結果表明，EMO、RH、AE和DHA的EC40分別為6.39×10-7、2.37×10-6、1.74×10-5和1.25×10-4mol·L-1。受試中藥抗菌劑的毒性順序為：EMO>RH>AE>DHA。DHA的單一毒性比EMO、RH和AE小，推測是由于DHA不具有羥基蒽醌結構，因此可能無法像EMO、RH和AE那樣通過氫鍵與NADH脫氫酶形成穩(wěn)定的復合物，從而其對A.fischeri的毒性比EMO、RH和AE小。而測定EMO、RH、AE和DHA的聯(lián)合毒性時發(fā)現(xiàn)，在高濃度區(qū)間時，聯(lián)合毒性作用模式均為拮抗，對A.fischeri的聯(lián)合抑制效果反而不如單一作用時強，推測是化合物之間互相競爭性地抑制NADH脫氫酶的活性，導致受試中藥抗菌劑對發(fā)光反應的抑制作用減弱，聯(lián)合毒性減弱，聯(lián)合毒性作用模式均為拮抗。

圖4 中藥抗菌劑的三元混合物的CRCs與IA曲線(包含95%置信區(qū)間)注：── 表示中藥抗菌劑的三元混合物的CRCs；──表示中藥抗菌劑的三元混合物的IA曲線；┅┅表示IA曲線的95%置信區(qū)間。Fig. 4 The CRCs and the IA curves with 95% confidence bands for the tertiary mixture of TCM antibacterialsNote: ── shows the CRCs for the tertiary mixture of TCM antibacterials; ── shows the IA curves for the tertiary mixture of TCM antibacterials; ┅┅ shows the 95% confidence bands of IA curves.

圖5 中藥抗菌劑的四元混合物的CRCs與 IA曲線(包含95%置信區(qū)間)注：── 表示中藥抗菌劑的四元混合物的CRCs；──表示中藥抗 菌劑的四元混合物的IA曲線；┅┅表示IA曲線的95%置信區(qū)間。Fig. 5 The CRCs and the IA curves with 95% confidence bands for the quaternary mixture of TCM antibacterialsNote: ── shows the CRCs for the quaternary mixture of TCM antibacterials; ── shows the IA curves for the quaternary mixture of TCM antibacterials; ┅┅ shows the 95% confidence bands of IA curves.

通過本文的研究，我們發(fā)現(xiàn)，這些中藥抗菌劑單一作用時對細菌具有較強的毒性作用，但是混合暴露時由于具有相同的靶蛋白，導致其聯(lián)合毒性減弱，因此，具有相同靶蛋白的中藥抗菌劑聯(lián)合暴露的生態(tài)風險可能低于其單一暴露；在后續(xù)研究中，我們考慮將不同結構、作用于不同靶位點或靶蛋白的藥物進行研究或?qū)⒅兴幙咕鷦┖蛡鹘y(tǒng)抗生素聯(lián)合進行聯(lián)合毒性研究。需要指出的是，本文研究的是EMO、RH、AE和DHA對A.fischeri的等毒性比聯(lián)合毒性，但是有時聯(lián)合毒性的結果與使用的目標化合物的濃度存在很大的關系，不同的濃度配比可能會出現(xiàn)不同的聯(lián)合毒性結果。因此，在后續(xù)研究中建議增加這些化合物對A.fischeri的非等比聯(lián)合毒性效應研究。本研究為中藥抗菌劑的聯(lián)合毒性的研究提供了參考，為今后中藥抗菌劑使用后的生態(tài)風險評價提供了新的依據(jù)和新的思路。