菊苣根超微粉對熱應激小鼠的保護作用研究

武 煒，李成會，蔡玉梅

（唐山師范學院生命科學系，河北唐山 063000）

熱應激是動物機體對熱激源做出的非特異性防御反應，在現代畜牧業(yè)的發(fā)展過程中，熱應激對動物的影響幾乎無法避免。當外界溫度過高，動物自身的體溫調節(jié)無法恢復正常時會出現生理機能紊亂，導致采食量下降、機體營養(yǎng)代謝消耗增加、免疫機能下降、生長性能和繁殖性能降低，嚴重時還會造成動物休克和死亡。

菊苣（.）又名苦苣、咖啡草，在我國暖溫帶地區(qū)廣泛分布，屬菊科菊苣屬多年生宿根植物。菊苣是多用途植物，富含菊糖、菊苣酸、三萜類、倍半萜內酯類、香豆素類、有機酸類、生物堿等有效成分，具備降糖降脂、清肝利膽、健胃消食、利尿消腫等藥用功效。作為優(yōu)質飼草，菊苣可改善動物生產性能，改善肉品質，提高畜禽對礦物質吸收能力，促進消化，增強機體免疫能力。但菊苣口感苦、塊根體積大、含水量高、利用率較低等限制了其在動物生產中的應用，而超微粉化技術可解決以上問題，該技術通過完全打破植物細胞壁保留全部化學成分，可促進有效成分的釋放、吸收和利用，顯著提高藥效作用。國內（外）對菊苣根超微粉這一新劑型的研究不多，更未見其對熱應激動物保護作用的報道。本試驗研究菊苣根超微粉對熱應激小鼠的保護作用，為利用菊苣根超微粉開發(fā)綠色添加劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選擇50只雄性、體重20～22 g昆明種健康小鼠，購自北京阿普瑞斯生物科技有限公司，飼喂基礎飼料，自由飲水。

1.2 材料與試劑 普那菊苣根購自遷安高效生態(tài)農業(yè)循環(huán)經濟示范園。將菊苣根洗凈后切片，干燥，水分低于10%。中藥粉碎機粉碎，過80目篩，得到粗粉。將粗粉進行低溫超微粉碎，過400目篩。菊苣根超微粉顆粒經激光粒度檢測儀檢測，粒徑D50低于75 nm。免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD），以上試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.3 主要儀器 試驗儀器主要包括中藥粉碎機（型號HT-500，鄭州中原華通機械廠）、超微粉碎機（型號為WZJ，濟南倍力粉技術工程有限公司）、激光粒度儀（型號為BT-9300，購自丹東百特儀器有限公司）、恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱（型號為LHP-160，常州榮華儀器制造有限公司）、全自動生化分析儀（型號為iMagic-V7，深圳庫貝爾生物科技有限公司）。

1.4 試驗設計 50只小鼠隨機分為對照組、熱應激組、超微粉低劑量組、超微粉高劑量組、粗粉組，每組10只，適應飼養(yǎng)7 d。超微粉低劑量組、超微粉高劑量組分別灌胃菊苣根超微粉懸液0.75、1.5g/（kg·d），粗粉組灌胃菊苣根粗粉懸液 1.5g/（kg·d），對照組、熱應激組灌喂等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。從第15天開始，將除對照組外的其他4組小鼠每天放入恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱，溫度（40±1）℃、濕度75%±5% 條件下處理2 h，連續(xù)熱應激7 d，期間各處理組小鼠持續(xù)灌胃給藥。分別于第14天和第21天空腹稱重，第21天熱應激處理結束后，各組小鼠眼眶取血，脫臼處死，取胸腺、肝、脾。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 體重和免疫器官指數的測定 第14天、第21天分別稱量每只小鼠體重，試驗結束時取小鼠胸腺和脾，4℃生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重。器官指數=器官重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.5.2 血清中IgA、IgG、ALT和AST活性的測定 小鼠血液室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液，試劑盒法檢測血清IgA和IgG含量、ALT和AST活性。

1.5.3 肝臟氧化指標的測定 取肝臟組織制備 10% 肝勻漿，試劑盒法檢測肝臟MDA、GSH含量及SOD 酶活性。

1.6 統(tǒng)計分析 通過SPSS 20.0對不同處理間體重、免疫器官指數、血清生化指標和肝臟氧化指標進行單因素方差分析，結果以平均值±標準誤表示。LSD法多重比較，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 菊苣根超微粉對熱應激小鼠體重的影響 表1可知，除對照組外，其他 4組小鼠熱應激后體重均下降，各組小鼠體重差異不顯著，說明熱應激導致小鼠體重減輕，菊苣根有抑制熱應激引發(fā)的小鼠體重下降的趨勢。

表1 菊苣根超微粉對熱應激小鼠體重的影響

2.2 菊苣根超微粉對熱應激小鼠免疫功能的影響 由表2可知，和對照組相比，熱應激組胸腺指數、脾指數和IgA含量均下降（＜0.05）。和熱應激組相比，超微粉高劑量組胸腺指數、脾指數和IgA含量均提升（＜0.05），超微粉低劑量組胸腺指數和IgA含量提升（＜0.05），粗粉組IgA含量提升（＜0.05）。和超微粉高劑量組相比，超微粉低劑量組的脾指數降低（＜0.05），粗粉組胸腺指數和脾指數降低（＜0.05）。

表2 菊苣根超微粉對熱應激小鼠免疫功能的影響

2.3 菊苣根超微粉對熱應激小鼠肝臟功能的影響 由表3可知，和對照組相比，熱應激組ALT和AST活力（＜0.01）、MDA含量（＜0.05）上升，GSH含量降低（＜0.05）。和熱應激組相比，超微粉高劑量組的ALT和AST酶 活（＜0.01）、MDA含 量（＜0.05）下降，SOD活性和GSH含量上升（＜0.05）；超微粉低劑量組的ALT（＜0.01）、AST酶活（＜0.05）下降，SOD含量上升（＜0.05）；粗粉組ALT（＜0.01）、AST酶活（＜0.05）下降。和超微粉高劑量組相比，超微粉低劑量組的AST酶活（＜0.01）、MDA含量（＜0.05）升高；粗粉組的AST酶活（＜0.01）、MDA含量（＜0.05）升高，SOD活性降低（＜0.05）。

表3 菊苣根超微粉對熱應激小鼠肝臟功能的影響

3 討 論

本試驗結果顯示，和對照組相比，熱應激組小鼠體重下降、胸腺指數、脾指數和IgA含量均顯著下降，ALT和AST活力均極顯著增加，MDA含量顯著上升、GSH含量顯著降低，提示熱應激模型建立成功。胸腺指數和脾臟指數直接反映免疫器官狀態(tài)及機體免疫功能的強弱,IgA和IgG直接參與機體體液免疫。胞內酶AST 和 ALT是評價肝功能的重要指標，當肝臟受損，脂質代謝出現異常，肝細胞膜通透性提高，細胞內AST、ALT會大量進入血液，濃度升高。本試驗結果說明熱應激處理影響小鼠采食量和營養(yǎng)物質吸收，造成體重降低，免疫功能下降；肝臟出現氧化應激反應，抗氧化酶系統(tǒng)受損，其中CAT、SOD酶活下降，抗氧化非酶系統(tǒng)中GSH含量降低，活性氧自由基堆積，MDA作為自由基與脂質發(fā)生過氧化物反應的最終氧化產物，水平顯著提高。

本試驗中，和熱應激組相比，超微粉高劑量組小鼠胸腺指數、脾指數和血清IgA水平顯著提升，說明高劑量菊苣根超微粉可提高熱應激小鼠免疫功能，這與Eugeniusz等發(fā)現菊苣根提取物可提升仔豬血清中IgA、IgG濃度的結果一致，其原因在于菊苣根中富含菊粉（菊糖）、菊苣酸等有效成分。Nattanan等證明在尼羅羅非魚魚苗日糧添加中5.0和10.0 g/ kg菊粉可增加血清中總免疫球蛋白含量。

楊巧麗等研究表明毛菊苣水提物對化學性、免疫性肝損傷和黃疸性肝炎模型小鼠均有明顯保護作用，可顯著抑制肝損傷引發(fā)的血清中ALT、AST活性升高。本試驗發(fā)現，和熱應激組相比，超微粉高劑量組小鼠血清ALT、AST水平極顯著下降，肝臟 MDA水平顯著下降，肝組織GSH含量和SOD酶活顯著上升，說明高劑量菊苣根超微粉可顯著緩解小鼠熱應激引發(fā)的肝臟氧化損傷。其機制可能在于菊苣酸通過激活小鼠體內的AMPK/Nrf 2通路和自噬相關通路，抑制NF-B和MAPK通路的上調，從而改善肝損傷。

目前加工菊苣根的傳統(tǒng)方法包括超濾技術、熱浸提汁、雙碳法和樹脂純化法聯用等，往往存在工序長、有效成分損失多、用水量大、耗能較高、提取率低等缺點。超微粉碎屬于現代粉體工程微粉化技術，加工條件局限性小，可使植物細胞破壁率高于96%，顆粒粒徑達到微米級別，有效成分能夠直接快速溢出、全部保留。本試驗結果顯示，超微粉高劑量組對熱應激小鼠的保護作用明顯好于超微粉低劑量組和粗粉組，超微粉低劑量組對熱應激小鼠的作用效果與粗粉組相近。其原因在于菊苣根超微粉化在不改變生物活性物質化學結構的基礎上，可通過提高有效成分的比表面積和孔隙率，加大溶出量和溶出速度，從而實現用量更少、效果更好。

4 結 論

本試驗結果顯示，菊苣根超微粉對熱應激小鼠有一定的保護作用，可提升其免疫功能，緩解熱應激造成的肝損傷，且效果明顯好于同等劑量的粗粉。