沒食子酸和三甲胺N-氧化物對(duì)體外瘤胃發(fā)酵和三甲胺代謝的影響

魏 晨，成海建，姜富貴，靳 青，宋恩亮*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

三甲胺（CHN，TMA）是擁有3個(gè)甲基基團(tuán)的含N物質(zhì)，是一種低嗅閾值的臭味氣體，也是肉牛場最主要的有機(jī)胺類污染物，對(duì)動(dòng)物和人的健康產(chǎn)生不利影響。對(duì)反芻動(dòng)物而言，TMA主要在瘤胃發(fā)酵和糞尿等排泄物堆放過程中產(chǎn)生，其中，瘤胃中的TMA來源于兩部分，一是源于瘤胃微生物對(duì)精料中豐富的具有N-三甲基結(jié)構(gòu)的膽堿、肉堿、甜菜堿、腺苷甲硫氨酸等前體物質(zhì)的分解，二是體內(nèi)三甲胺N-氧化物（TMAO）隨唾液返回瘤胃后被TMAO還原酶分解產(chǎn)生。瘤胃中產(chǎn)生的TMA一部分被微生物分解產(chǎn)生氨和甲烷，另一部分通過瘤胃壁吸收進(jìn)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)化為TMAO，再通過唾液返回瘤胃或隨尿液排出，TMA還會(huì)隨動(dòng)物呼吸直接排出體外。因此，有效減少瘤胃TMA的產(chǎn)生將有利于環(huán)境保護(hù)和人畜健康。

單寧屬于多酚類物質(zhì)，在植物中分布十分廣泛。沒食子酸（3,4,5-三羥基苯甲酸，GA）是單寧的主要活性單體之一，具有減少蛋白質(zhì)在瘤胃中無效降解的保護(hù)特性。也有研究表明，單寧的酚羥基還能與胺N-氧化物結(jié)合，是TMAO等物質(zhì)的高效吸附劑。然而，GA是否能通過抑制飼料中前體物質(zhì)分解或保護(hù)隨唾液進(jìn)入瘤胃的TMAO，從而減少瘤胃TMA的產(chǎn)生還未見相關(guān)報(bào)道。此外，隨唾液返回瘤胃的TMAO對(duì)瘤胃發(fā)酵過程產(chǎn)生的影響還不清楚。因此，本試驗(yàn)通過體外試驗(yàn)?zāi)M瘤胃發(fā)酵過程，將高精料飼糧作為發(fā)酵底物，研究添加GA和TMAO對(duì)體外瘤胃發(fā)酵和TMA代謝的影響，為通過營養(yǎng)途徑改善瘤胃發(fā)酵和調(diào)控瘤胃TMA代謝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物 GA（G131992，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）純度99%，TMAO[317594，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]純度95%。選用3頭3周歲、平均體重為（473±15）kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的利魯公牛（利木贊?！留斘鼽S牛）作為試驗(yàn)動(dòng)物，飼喂由70%全株玉米青貯和30%精料組成的飼糧[干物質(zhì)（DM）基礎(chǔ)]，試驗(yàn)動(dòng)物飼糧按《肉牛營養(yǎng)需要和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》制定，原料組成及營養(yǎng)成分與文獻(xiàn)一致，每天07:00和17:00各喂1次，自由采食，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣 參考Wei等和Aii等的試驗(yàn)處理或結(jié)果，采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，設(shè)置對(duì)照組、15 mg GA/g DM組、5 mg TMAO/g DM組、5 mg TMAO+15 mg GA/g DM組。底物由70%精料和30%全株玉米青貯組成，原料組成及營養(yǎng)成分見表1。稱取粉碎后過2 mm篩的底物1.0 g（DM基礎(chǔ)），放入已標(biāo)記、用丙酮浸洗過并稱重的Ringbio濾袋中并封口，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，另設(shè)2個(gè)空白對(duì)照（只有濾袋）。早上飼喂前，通過瘤胃瘺管分別從瘤胃的不同位置采集3頭牛的瘤胃食糜，用4層紗布過濾，混合均勻，并立即放入?yún)捬趺荛]保溫瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于39℃恒溫水浴中。進(jìn)行培養(yǎng)前，將濾袋放入培養(yǎng)瓶，參照Goering等的方法配置無氧培養(yǎng)液。用分液器將15 mL瘤胃液和45 mL預(yù)熱培養(yǎng)液（1:3）加入125 mL培養(yǎng)瓶中。用橡膠塞和壓接鋁帽密封后，置于120 r/min、39℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)開始后的4、8、12、18、24 h，用測(cè)壓計(jì)（06-664-21，F(xiàn)isher Scientific Inc.）測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)瓶的氣壓值。采集2、4、8、12 h瘤胃發(fā)酵液，-80℃保存，用于測(cè)定三甲胺氮（TMA-N）。培養(yǎng)24 h后，將各培養(yǎng)瓶置于冰上終止發(fā)酵。將發(fā)酵24 h濾袋從瓶中取出，用蒸餾水沖洗干凈，置于65℃烘箱中48 h，用以計(jì)算DM消失率（DMD），隨后測(cè)定粗蛋白質(zhì)消失率（CPD）。用pH計(jì)（HI 9125，Hanna Instruments Inc.）測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)瓶中發(fā)酵液的pH后，取1 mL上清液與0.2 mL 25%偏磷酸混勻，置于-20℃保存，進(jìn)行揮發(fā)性脂肪酸（VFA）測(cè)定。取1 mL上清液與0.2 mL 1%硫酸混勻，置于-20℃保存，用于氨態(tài)氮（NH-N）測(cè)定。

表1 體外發(fā)酵底物原料組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)） %

1.3 化學(xué)分析 將底物樣品粉碎，過1 mm篩，參照AOAC（1990）的方法測(cè)定DM、OM含量。采用凱氏定氮法測(cè)定底物和殘?jiān)偟∟）含量，并計(jì)算CP含量。參照Van Soest等的方法測(cè)定底物NDF和ADF含量。根據(jù)Topuz等的方法，使用分光光度計(jì)（ULTROSPEC-3100，Amersham）于410 nm處測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液TMA-N濃度。參照Erwin等的氣相色譜分析法，使用氣相色譜儀（Model 7890A，Agilent Technologies）測(cè)定發(fā)酵液樣品中VFA含量。采用Chaney等提出的方法測(cè)定發(fā)酵液氨態(tài)氮（NH-N）濃度。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì) 采用Mauricio等提出的方程計(jì)算各氣壓值對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣量，并進(jìn)行空白對(duì)照校正，總產(chǎn)氣量為各氣體采樣時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量之和：

產(chǎn)氣量（mL）=0.18+[3.697×氣壓值（psi）]+[0.082 4×氣壓值平方（psi）]

進(jìn)行空白對(duì)照校正后，每個(gè)處理組累積TMA-N濃度為各組瘤胃發(fā)酵液采樣時(shí)間點(diǎn)TMA-N濃度之和。

采用SAS 9.1中混合模型的重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)程序分析各時(shí)間點(diǎn)TMA-N濃度，采用一般線性模型對(duì)底物消失率、總產(chǎn)氣量、各發(fā)酵參數(shù)、累積TMA-N濃度進(jìn)行方差分析，采用Duncan′s法比較各組均值，≤0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 GA和TMAO對(duì)體外24 h瘤胃底物消失率和產(chǎn)氣量的影響 由表2可知，各組間DMD無顯著差異，但添加TMAO有提高底物DMD的趨勢(shì)（=0.08）。TMAO組和TMAO+GA組底物CPD高于其他兩組（＜0.01），且以TMAO組最高；與對(duì)照組相比，添加GA降低了CPD（＜0.01）。TMAO組總產(chǎn)氣量高于其他各組（＜0.05），其他組間無顯著差異。

表2 GA和TMAO對(duì)體外24 h瘤胃底物消失率和產(chǎn)氣量的影響

2.2 GA和TMAO對(duì)體外24 h瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表3可知，與對(duì)照組相比，添加TMAO有降低pH（=0.06）和提高TVFA濃度（=0.09）的趨勢(shì)。TMAO組和TMAO+GA組的NH-N濃度高于對(duì)照組（=0.0）5，且TMAO組最高，GA組的NH-N濃度低于對(duì)照組（=0.05）。與對(duì)照組相比，其他三組的異戊酸摩爾比例有降低趨勢(shì)（=0.08）。

表3 GA和TMAO對(duì)體外24 h瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3 GA和TMAO對(duì)體外瘤胃各時(shí)間點(diǎn)和累積TMA-N濃度的影響 由表4可知，TMA主要在瘤胃發(fā)酵8 h前產(chǎn)生。與對(duì)照組相比，GA組的TMA-N濃度無顯著差異，添加TMAO提高了2 h TMA-N濃度（＜0.01），有提高4 h TMA-N濃度的趨勢(shì)（=0.07）。TMAO+GA組2 h 的TMA-N濃度高于對(duì)照組和GA組（＜0.01），低于TMAO組。添加TMAO組的累積TMA-N濃度最高，TMAO+GA組次之，對(duì)照組和GA組間無顯著差異且最低。

表4 GA和TMAO對(duì)體外瘤胃各時(shí)間點(diǎn)和累積TMA-N濃度的影響

3 討 論

3.1 GA和TMAO對(duì)體外瘤胃發(fā)酵的影響 營養(yǎng)物質(zhì)消失率和產(chǎn)氣量是瘤胃發(fā)酵作用的直接反映。有研究表明，GA能夠被瘤胃微生物分解，并作為能源物質(zhì)被利用，添加40 mg GA/kg DM能夠顯著提高底物（精粗比為50:50）48 h的DMD和總產(chǎn)氣量，然而本試驗(yàn)的結(jié)果與此并不一致，可能的原因是本試驗(yàn)中GA的添加劑量為15 mg/kg DM，低于前者，且底物組成不同（精粗比為70:30）、瘤胃發(fā)酵時(shí)間（24 h）也較短，導(dǎo)致GA對(duì)瘤胃發(fā)酵過程的促進(jìn)作用不明顯。TMAO對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響還未見相關(guān)報(bào)道。與GA作用效果不同，本試驗(yàn)中添加5 mg/kg DM的TMAO促進(jìn)了底物DMD和總產(chǎn)氣量，可能是瘤胃液中存在產(chǎn)生和利用甲基化合物的微生物，具有N-三甲基結(jié)構(gòu)的TMAO被分解后為這些微生物提供了生長條件，從而促進(jìn)了瘤胃發(fā)酵過程，由此可推測(cè)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的TMAO隨唾液返回瘤胃后也具有改善瘤胃發(fā)酵的作用。TMAO+GA組的DMD和總產(chǎn)氣量低于TMAO組，說明GA對(duì)TMAO的分解利用產(chǎn)生了一定抑制作用。本試驗(yàn)中添加15 mg GA/kg DM抑制了底物CP降解，這與Wei等的結(jié)果一致，符合多酚類物質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)從而減少其降解的特性。添加TMAO則提高了底物CPD，可能的原因是瘤胃中的真桿菌（）不但能以TMAO為底物產(chǎn)生甲基化合物實(shí)現(xiàn)自身生長，還可以作為一種主要的瘤胃蛋白分解菌促進(jìn)底物CP的分解，但這一過程促進(jìn)了蛋白質(zhì)在瘤胃中的無效分解。TMAO+GA組的CPD高于對(duì)照組、低于TMAO組，可能是TMAO與GA相互作用減弱了GA對(duì)底物蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。

瘤胃發(fā)酵參數(shù)反映了添加物質(zhì)對(duì)瘤胃內(nèi)環(huán)境的作用效果。本研究中，添加TMAO降低了pH，提高了TVFA濃度，這與TMAO促進(jìn)底物分解的結(jié)果一致，說明TMAO促進(jìn)了碳水化合物的分解，VFA總量提高，pH降低。添加GA對(duì)DMD沒有影響，因此，GA組的pH和TVFA濃度沒有變化。根據(jù)此前分析，同時(shí)添加TMAO和GA后，GA減弱了TMAO對(duì)瘤胃發(fā)酵的促進(jìn)作用，因此，TMAO+GA組的DMD和pH、TVFA濃度的結(jié)果也相符。本試驗(yàn)中瘤胃NH-N來源于底物CP和添加TMAO的降解，GA組低于對(duì)照組，TMAO組高于對(duì)照組，這與分別添加GA和TMAO對(duì)底物CPD的分析結(jié)果一致，TMAO+GA組的NH-N濃度低于TMAO組，與對(duì)CPD的影響一致，這也證明了TMAO促進(jìn)了CP的瘤胃分解，GA則相反。雖然同時(shí)添加TMAO和GA的CPD高于對(duì)照組，部分TMAO也可能被分解產(chǎn)生NH-N，但是同時(shí)添加TMAO和GA的NH-N濃度與對(duì)照組無差異，這說明本組中產(chǎn)生的NH-N也在被消耗或利用，具體原因有待進(jìn)一步研究。對(duì)于各VFA的摩爾比例，GA和TMAO影響較小，添加GA僅降低了異戊酸的摩爾比例，這與Wei等短期批次培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果一致。添加TMAO和同時(shí)添加TMAO和GA也降低了異戊酸的摩爾比例，而異戊酸主要源于部分支鏈氨基酸的分解，這說明GA和TMAO都可能抑制了該過程。

3.2 GA和TMAO對(duì)體外瘤胃TMA代謝的影響 Aii等研究發(fā)現(xiàn)，肉牛飼喂基礎(chǔ)日糧或提供肉堿、TMAO等前體物質(zhì)后2～3 h時(shí)TMA濃度達(dá)到最高水平，這與本試驗(yàn)中在2 h達(dá)到最高水平的結(jié)果一致。通過瘤胃瘺管投入TMAO后，TMA濃度在1 h內(nèi)迅速提高，然后在3 h內(nèi)基本降至添加前水平。而本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加的TMAO主要在4 h時(shí)被分解完全，可能是本試驗(yàn)中產(chǎn)生的TMA不會(huì)通過瘤胃壁吸收或以氣態(tài)形式溢出，只有被分解一條路徑。對(duì)于累積TMA-N濃度，與對(duì)照組相比，添加GA并沒有顯著改變瘤胃TMA-N濃度，這說明GA對(duì)底物中含有的TMA前體物質(zhì)的分解基本沒有影響。對(duì)比TMAO組和TMAO+GA組的結(jié)果可知，GA在瘤胃中表現(xiàn)出對(duì)TMAO的保護(hù)特性，說明GA對(duì)TMAO的分解過程具有抑制作用，其原因可能是GA作為單寧類物質(zhì)通過酚羥基（H-O-Ph）結(jié)合TMAO[（CH）-N-O-]形成較穩(wěn)定的復(fù)合物，亦或是大腸桿菌是胃腸道中TMAO還原酶的重要來源，而GA可以被瘤胃微生物代謝分解產(chǎn)生鄰苯三酚（1,2,3-苯三酚），后者對(duì)大腸桿菌具有抑制作用，通過減少TMAO還原酶的來源抑制了TMAO的分解，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，TMAO促進(jìn)了體外瘤胃發(fā)酵，并提高了TMA產(chǎn)生，GA對(duì)底物中TMA前體物質(zhì)代謝產(chǎn)生TMA的影響很小，但降低了TMAO瘤胃代謝產(chǎn)生的TMA濃度。