飼料級(jí)檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌作用

晏家友，杜亞楠，李書偉，湯文杰，鄺聲耀

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066；3.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶榮昌 402460；4.四川省畜科飼料有限公司，四川成都 610066；5.畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雙流 616200）

為了優(yōu)化畜群的整體生產(chǎn)水平，現(xiàn)代化養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍采用仔豬早期斷奶技術(shù)。早期斷奶仔豬的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，腸道微生物區(qū)系易受外界變化的影響，容易出現(xiàn)采食量下降、生長(zhǎng)停滯，甚至發(fā)生腹瀉和死亡等“早期斷奶應(yīng)激綜合征”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有1.6億頭仔豬死于腹瀉。因而，斷奶仔豬腹瀉已成為制約生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，直接影響到養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬產(chǎn)生腹瀉的原因有很多，其中斷奶后腸道菌群的失調(diào)尤為突出。研究表明，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和豬霍亂沙門氏菌是引起斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌。銅具有優(yōu)良的抗菌性能，對(duì)大腸桿菌等具有殺滅作用，并且不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。硫酸銅是仔豬飼料中銅的主要添加形式，但是由于其吸收率低、排放量高，已成為畜牧生產(chǎn)中繼抗生素之后的又一大憂患。因此，新銅源的研發(fā)和應(yīng)用勢(shì)在必行。2019年4月16日，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第162號(hào)公告正式批準(zhǔn)檸檬酸銅作為新型飼用有機(jī)銅源在斷奶仔豬飼料中使用。研究顯示，檸檬酸銅安全性好、添加量低、排放量少，可以有效提供銅元素，促進(jìn)仔豬健康生長(zhǎng)，并可以顯著降低其腹瀉率。然而，關(guān)于檸檬酸銅調(diào)控?cái)嗄套胸i腹瀉的作用機(jī)理尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究檸檬酸銅對(duì)豬致病性大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌效果，為進(jìn)一步開(kāi)展檸檬酸銅抗斷奶仔豬腹瀉的機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌和豬霍亂沙門氏菌由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，試驗(yàn)前在斜面培養(yǎng)基上接種。

1.1.2 銅源 飼料級(jí)檸檬酸銅（四川省畜科飼料有限公司）實(shí)測(cè)含量為99.3%，其中銅含量實(shí)測(cè)值為35.0%。

1.1.3 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基和MHB液體培養(yǎng)基等均為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器設(shè)備 試驗(yàn)所需儀器設(shè)備主要包括超凈工作臺(tái)（Airtech）、高壓蒸汽滅菌鍋（Panasonic）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（Crystal）、恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）和電子天平（Precisa）等。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 利用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用無(wú)菌生理鹽水配制成0.5 McFarland濃度的菌懸液。

1.2.2 檸檬酸銅溶液的制備 將檸檬酸銅溶解后，分別配制成濃度為0.15 g/mL（銅含量26.5 mg/mL）、0.20 g/mL（銅含量35.3 mg/mL）和0.25 g/mL（銅含量44.1 mg/mL）的檸檬酸銅溶液；同時(shí)配制不含檸檬酸銅的溶液作為對(duì)照。

1.2.3 抑菌圈直徑測(cè)定 參照《抗菌劑藥敏紙片》（YY/T 1191-2011），利用Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行紙片擴(kuò)散試驗(yàn)。將6 mm定性濾紙小圓片分裝于潔凈干燥燒杯內(nèi)，高壓蒸汽滅菌后備用。無(wú)菌操作下，將滅菌濾紙片浸于1 mL各濃度檸檬酸銅溶液中。吸取200 μL菌懸液均勻涂于培養(yǎng)基中。采用無(wú)菌鑷子夾取浸泡后的濾紙片貼于培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度重復(fù)4次，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。抑菌敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（d）＞20 mm為極敏、15 mm＜d≤20 mm 為高敏、10 mm＜d≤15 mm為中敏、d≤10 mm 為低敏，無(wú)抑菌圈為不敏感。

1.2.4 最小抑菌濃度測(cè)定 參考牛彪等試驗(yàn)方法，利用MHB液體培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋試驗(yàn)。將已滅菌試管排于超凈工作臺(tái)，每一排9支試管分別編號(hào)1～9號(hào)，向每支試管中加入1 mL MHB液體培養(yǎng)基。吸取0.25 g/mL檸檬酸銅溶液1 mL于第1號(hào)試管，連續(xù)吹打混勻后，采用倍比稀釋法取1 mL檸檬酸銅溶液至第2、3、4、5、6、7、8號(hào)試管，配制成不同濃度的檸檬酸銅溶液。向1～9號(hào)試管中分別加入3.8 mL MHB液體培養(yǎng)基，然后向1～7號(hào)及9號(hào)試管中分別加入200 μL菌懸液。前7號(hào)試管中含有的檸檬酸銅濃度分別為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625 mg/mL，8號(hào)試管不加菌液作為液體培養(yǎng)基及空白對(duì)照，9號(hào)試管不加檸檬酸銅溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。將試管放入37℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)24 h，然后從各試管中吸取200 μL培養(yǎng)液于培養(yǎng)基，再用涂布棒涂勻后于37℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落生長(zhǎng)，判斷檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度（MIC，未出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)的最低濃度）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010處理后，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌圈直徑的影響由表1可知，與對(duì)照組相比，0.15、0.20、0.25 g/mL檸檬酸銅組大腸桿菌抑菌圈直徑分別提高36.05%（＜0.05）、56.40%（＜0.05）和92.91%（＜0.05），沙門氏菌抑菌圈直徑分別提高9.38%（＞0.05）、48.23%（＜0.05）和113.40%（＜0.05）。

表1 檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌圈直徑的影響 mm

由圖1和圖2可知，大腸桿菌對(duì)0.15、0.20 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出中度敏感，大腸桿菌對(duì)0.25 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出高度敏感；沙門氏菌對(duì)0.15 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出低度敏感、對(duì)0.20 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出中度敏感、對(duì)0.25 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出高度敏感。

圖1 檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑

圖2 檸檬酸銅對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑

2.2 檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度測(cè)定 檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度均為6.25 mg/mL，即檸檬酸銅稀釋倍數(shù)為40。

3 討 論

銅是動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素，在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫功能、改善膚色毛況和提高繁殖性能等方面發(fā)揮著重要的營(yíng)養(yǎng)生理作用。冷向軍等研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加250 mg/kg硫酸銅，仔豬腹瀉率降低了35.39%。梅紹鋒進(jìn)一步研究指出，隨著日糧中銅的添加量提高，仔豬的腹瀉率逐漸降低，其中銅添加量為250 mg/kg時(shí)仔豬腹瀉率較基礎(chǔ)日糧組顯著降低。高劑量硫酸銅的抗腹瀉作用可能因其在動(dòng)物消化道內(nèi)發(fā)揮了類抗生素的抗菌作用，進(jìn)而改善了消化道內(nèi)環(huán)境。但是，“高銅”的使用對(duì)動(dòng)物自身、生態(tài)環(huán)境及動(dòng)物產(chǎn)品的品質(zhì)都構(gòu)成了潛在的危害。檸檬酸銅是檸檬酸與銅離子形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物學(xué)效價(jià)高的離子型化合物，也是我國(guó)食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑標(biāo)準(zhǔn)中允許使用的有機(jī)銅源。銅的配位可以增強(qiáng)檸檬酸的生物活性，因而檸檬酸銅對(duì)細(xì)菌和真菌都具有明顯的抑制效果。現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，在斷奶仔豬日糧中添加低劑量的檸檬酸銅可以達(dá)到添加高劑量硫酸銅相近的促生長(zhǎng)效果，并可增強(qiáng)斷奶仔豬的抗腹瀉能力。Peng等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸銅可以顯著降低盲腸大腸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌數(shù)量，從而降低幼齡動(dòng)物的腹瀉率和死亡率。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，0.20 g/mL檸檬酸銅和0.25 g/mL檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑顯著高于對(duì)照組；且隨著檸檬酸銅濃度升高，大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)檸檬酸銅的敏感度增強(qiáng)，其中大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)0.25 g/mL檸檬酸銅均表現(xiàn)出高度敏感。此外，檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度均為6.25 mg/mL。綜合分析，飼料級(jí)檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌均具有較好的抑菌效果。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，0.20 g/mL檸檬酸銅和0.25 g/mL檸檬酸銅組大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑較對(duì)照組顯著提高；大腸桿菌和沙門氏菌對(duì)0.25 g/mL檸檬酸銅表現(xiàn)出高度敏感；檸檬酸銅對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC均為6.25 mg/mL。