模式動物（果蠅）體重高低雜種優(yōu)勢組合的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

孫新宇，王 玨，凌 遙，鮑海港，吳常信

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

雜種優(yōu)勢是指雜交后代在生長、繁殖、抗病力、抗逆性等性狀上優(yōu)于雙親均值的現(xiàn)象，受遺傳與表觀遺傳、表型與環(huán)境因素的綜合影響。雜種優(yōu)勢在動物遺傳育種與繁殖領(lǐng)域均有廣泛研究和應(yīng)用，如探究雜種優(yōu)勢對豬精子的影響、結(jié)合性能測定和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)預(yù)測家畜雜交改良效果等。利用雜種優(yōu)勢是提高動物產(chǎn)量與質(zhì)量的重要手段之一，至今仍廣泛使用。目前雜種優(yōu)勢的遺傳機理尚不明確，主要有兩種假說，分別是顯性假說和超顯性假說，但均有局限，不能統(tǒng)一而詳盡地解釋所有現(xiàn)象。隨著一些重要模式生物（如果蠅、水稻、擬南芥）的全基因組測序完成以及基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和表觀遺傳學(xué)技術(shù)的不斷完善，解釋雜種優(yōu)勢的遺傳機理成為亟待解決的問題。果蠅很多基因與人類和哺乳動物的具有同源性，故常作為經(jīng)典模式動物廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。而且果蠅具有飼養(yǎng)成本低、表型區(qū)分明顯、易大批量繁殖、試驗周期短及效率高等優(yōu)點，一直是研究者們研究雜交與近交的重要材料。本研究利用果蠅品系間雜交模擬畜禽生產(chǎn)中二元雜交，針對體重性狀的雜種優(yōu)勢利用RNAseq及生物信息學(xué)分析方法對其遺傳機理進(jìn)行相關(guān)研究，以期為畜禽生產(chǎn)中體重雜種優(yōu)勢的探究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗選取5個黑腹果蠅突變品系，分別是極紫眼（dp）、黑檀體（e）、白眼（w）、殘翅（vg）和黃體（y），均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院模式動物實驗室提供。

1.1.2 試劑與儀器 高精度電子天平（德國Sartorius AG）、高速電動組織研磨杵（北京市天根生化科技有限公司）；無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Trizol（美國Invitrogen公司）、異丙醇（北京市化學(xué)試劑有限公司）、氯仿（北京市化學(xué)試劑有限公司）、DNA 2000 Marker（北京市欣匯天科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 果蠅雜交的設(shè)計 分別在5個果蠅品系中隨機選取雌雄果蠅各10只，10 ♂×10 ♀各自純繁一代（G代）后開展5×5完全雙列雜交實驗，每個雜交組合選擇2只雄蠅與 5只雌蠅交配，得到的后代中雜種記為F，純種記為G，各組合雜交方式見表1。

表1 5×5雙列雜交表

整個雜交過程共做2次重復(fù)實驗，上述所有雜交實驗中，每個雜交組合均有3個有效重復(fù)，最終體重值為3個有效重復(fù)的均值。雌蠅均是取羽化8 h內(nèi)的處女蠅進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 體重雜種優(yōu)勢率的計算及檢驗 雜種優(yōu)勢是指雜種群體均值高于親本群體均值的部分，一般用雜種優(yōu)勢率（H %）來表示。H%=（雜種均值-雙親均值）/雙親均值×100%。

本實驗中F體重雜種優(yōu)勢的計算公式：H%=（F雄性體重均值—兩親本系雄性的體重均值）/雙親本系雄性的體重均值×100%。

雌果蠅羽化8 h內(nèi)交配后即可產(chǎn)生受精卵，其體重會隨著受精卵的發(fā)育、成熟而增大。為排除其他因素對體重的影響，本研究只記錄雄性果蠅的體重。一次性稱取10只雄果蠅的重量取平均值作為1個測量值，每個測量值稱取3個有效平行以確保實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.2.3 秩相關(guān)計算 本研究2次實驗的秩相關(guān)計算公式：

式中，d為每對觀察值所對應(yīng)的秩次之差；n為對子數(shù)。

1.2.4 果蠅總RNA的提取 采用Trizol法提取果蠅總RNA，通過Nanodrop超微量核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA的濃度和純度，整個實驗過程均在冰上進(jìn)行，提取檢測完成后于-80℃保存。

1.2.5 果蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析 經(jīng)核酸蛋白測定儀純度檢測及凝膠電泳檢測皆合格的RNA樣品交由北京諾禾致源生物信息科技有限公司測序，質(zhì)檢合格后構(gòu)建cDNA文庫，然后基于Illumina HisSeq測序平臺對文庫進(jìn)行測序。使用HISAT軟件將所得樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與Ensembl數(shù)據(jù)庫中的黑腹果蠅參考基因組進(jìn)行比對；用StringTie軟件對每個樣本轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝和量化；基于DESeq2軟件分析差異表達(dá)基因和差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。使用DAVID6.8 (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2次重復(fù)實驗體重雜種優(yōu)勢率及檢驗

2.1.1 2次重復(fù)實驗G雄性體重 為排除其他因素對體重的影響，本研究只記錄雄性果蠅的體重。利用秩相關(guān)公式計算得r=1.000，查表知n=5時，顯著性水平為0.05的臨界值為1.000，該秩相關(guān)系數(shù)極顯著。即G雄性2次排隊結(jié)果重復(fù)性高（表2）。

表2 G0雄性單只果蠅體重 μg

2.1.1 2次重復(fù)實驗F代雜交雄性體重 結(jié)合該表所得數(shù)據(jù)，利用秩相關(guān)公式計算得秩相關(guān)系數(shù)r=0.681，根據(jù)Spearman秩相關(guān)系數(shù)界值表查得n=20時，顯著性水平為0.05的臨界值為0.447，因此該秩相關(guān)系數(shù)顯著，即F體重雜種優(yōu)勢率2次重復(fù)排隊結(jié)果一致性較好。雜種優(yōu)勢的顯著性檢驗結(jié)果見表3，y♂vg♀、dp♂w♀、♂w♀e3個組合體重雜種優(yōu)勢率最高且差異極顯著，而vg♂dp♀、dp♂y♀、♂w♀dp 3個組合體重雜種優(yōu)勢最低且差異不顯著。故根據(jù)秩相關(guān)和顯著性檢測篩選得出3個體重高雜種優(yōu)勢組合（y♂vg♀、dp♂w♀、♂w♀e）和3個體重低雜種優(yōu)勢組合（vg♂dp♀、dp♂y♀、♂w♀dp）。

表3 F1代雄性單只果蠅體重 μg

2.2 RNA質(zhì)量檢測和RNA-seq相關(guān)性檢測 所有提取的RNA樣品經(jīng)過Nanodrop超微量核酸蛋白測定儀檢測后，OD/OD和OD/OD都在2.0左右。測序樣品的樣品濃度都在150 ng/μL以上，完整度（RIN）均在7.0上下（昆蟲的檢測標(biāo)準(zhǔn)RIN≥6.5即可），質(zhì)量均為A，檢測結(jié)果中各項指標(biāo)均符合質(zhì)量要求。瓊脂糖凝膠電泳檢測后的結(jié)果見圖1，所有RNA樣品的3個條帶都清晰可見，且18 S較亮，28 S亮度較弱，符合果蠅RNA條帶的質(zhì)量檢測要求，無明顯拖尾彌散的降解現(xiàn)象，質(zhì)量較好，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 黑腹果蠅RNA凝膠電泳圖

本研究共設(shè)2個生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行檢驗，得到任意樣品2個生物學(xué)重復(fù)的絕對系數(shù)都在0.929～0.999，說明兩重復(fù)相關(guān)性較高，可用于后續(xù)分析。

2.3 高雜種優(yōu)勢組合與低雜種優(yōu)勢組合間的差異表達(dá)基因功能分析 經(jīng)DESeq2分析得到體重高雜種優(yōu)勢3個組合的差異表達(dá)基因共有2 659個，體重低雜種優(yōu)勢3個組合的差異表達(dá)基因有415個。對體重高雜種優(yōu)勢3個組合和低雜種優(yōu)勢3個組合的差異表達(dá)基因取交集，共有275個相同的差異表達(dá)基因（圖2）。

圖2 體重的高雜種優(yōu)勢組合和低雜種優(yōu)勢組合的差異表達(dá)基因

分別對高雜種優(yōu)勢組和低雜種優(yōu)勢組特異的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能聚類和KEGG富集分析，根據(jù)值對富集到的結(jié)果進(jìn)行顯著性排序（＜0.05），選取顯著性排名前30的結(jié)果作圖，GO功能聚類分析結(jié)果見圖3和圖4，KEGG富集分析結(jié)果見圖5。富集結(jié)果表明，雜種優(yōu)勢低組合特有的差異表達(dá)基因所富集通路較少；雜種優(yōu)勢高組合特有的差異表達(dá)基因均顯著富集到糖類代謝、脂類代謝通路以及高雜種優(yōu)勢組合聚類顯著且低雜種優(yōu)勢組合沒有的通路，如谷胱甘肽代謝通路（Glutathione Metabolism Pathway）和抗壞血酸和醛酸代謝通路（Ascorbate and Aldarate Metabolism Pathway）等通路。

圖3 體重雜種優(yōu)勢高組特有的2384個基因的GO功能聚類

圖4 體重雜種優(yōu)勢低組特有的140個基因的GO功能聚類

圖5 體重雜種優(yōu)勢高組特有的2 384個基因的KEGG富集分析

3 討 論

在畜禽生產(chǎn)中，直接利用5個品系進(jìn)行二元配套系雜交會耗費大量的時間、資源、人力和物力，而果蠅憑借其強大的繁殖力和短暫的世代間隔，可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)一個龐大而完整的雜交體系，是理想的探究雜種優(yōu)勢的模型。本研究選取的5個果蠅品系差異較大，可以用來模擬生產(chǎn)水平不同的畜禽品種，例如以不同品系的果蠅體重模擬豬、牛、羊、雞各配套系的體重，以果蠅9 d內(nèi)成蟲數(shù)的指標(biāo)可以模擬蛋雞產(chǎn)蛋后孵化數(shù)。本研究以果蠅為研究對象，針對體重性狀雜種優(yōu)勢展開探討，為實際生產(chǎn)中與體重性狀相關(guān)的篩選和預(yù)測工作提供理論上的驗證和支撐。本實驗結(jié)果表明，對于果蠅體重性狀，大多數(shù)雜種優(yōu)勢率都為正值，說明兩品系雜交后代的表型值要優(yōu)于雙親均值，即產(chǎn)生了雜種優(yōu)勢。

本研究對體重高雜種優(yōu)勢組合特有的2 384個基因進(jìn)行GO分析，在前30項富集條目中有較多基因與糖代謝、脂代謝有關(guān)，還發(fā)現(xiàn)有少量基因與氧化還原和亞鐵離子活動有關(guān)，如oxidation-reduction process、iron ion binding等；經(jīng)富集分析發(fā)現(xiàn)，糖代謝通路和脂代謝通路被顯著富集到。其中糖代謝通路中包含（編碼海藻糖合成酶）、（編碼尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶）等基因。海藻糖合成酶可以催化尿苷二磷酸和6-磷酸葡萄糖反應(yīng)形成海藻糖。海藻糖不僅作為能源和合成細(xì)胞成分的葡萄糖存儲倉庫，還有結(jié)構(gòu)或運輸?shù)淖饔?、保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)免受應(yīng)力的不利影響，對體重增加和生物抗逆起到重要作用。而存在于許多脊椎動物的肝微粒體中，是重要的生物轉(zhuǎn)化酶之一?？梢源呋孜锱c尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基結(jié)合，使其親水性增加，利于從毒物和藥物體內(nèi)排出，對體重高優(yōu)勢的形成具有緊密聯(lián)系。而富集到的脂代謝通路中含有（編碼脂肪酸合成酶）、（編碼活性調(diào)節(jié)的細(xì)胞骨架蛋白）等基因。FASN是一種基本的代謝酶類，在脂肪酸合成中至關(guān)重要。有研究表明，是脂肪沉積性狀的候選基因之一，故推測也是造成果蠅體重增加的原因之一，進(jìn)一步證實了這些代謝通路與體重高雜種優(yōu)勢的形成有緊密聯(lián)系。

除了糖代謝通路和脂代謝通路被顯著富集到，還有2條與谷胱甘肽和抗壞血酸代謝有關(guān)通路也被富集到（Glutathione Metabolism Pathway，Ascorbate and Aldarate Metabolism）。谷胱甘肽和抗壞血酸代謝通路在體重高雜種優(yōu)勢組合中被顯著富集到而在體重低雜種優(yōu)勢組合中未被富集到，這暗示著體重雜種優(yōu)勢可能與機體抗氧化能力和藥物代謝能力有著密切聯(lián)系。谷胱甘肽幾乎存在于機體的每個細(xì)胞中，它能幫助維持機體正常的免疫系統(tǒng)功能。谷胱甘肽上的半胱氨酸易于某些藥物、毒素和結(jié)合，從而具有抗氧化、解毒的作用?？箟难嵊址Q維生素C，具有強還原能力，與谷胱甘肽、亞鐵離子一同具有抗氧化能力。目前，有關(guān)動物毒理效應(yīng)的研究報道有很多，重金屬污染物對動物機體的作用有引起細(xì)胞內(nèi)活性氧過量產(chǎn)生，從而造成細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的氧化損傷及膜脂過氧化，且重金屬可與抗氧化酶和谷胱甘肽發(fā)生作用，影響胞內(nèi)酶的活性與濃度，干擾體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，進(jìn)而影響生物體的生長、發(fā)育和繁殖。從上述代謝過程來看，推測這些潛在通路對畜禽生長發(fā)育和體重雜種優(yōu)勢有著緊密聯(lián)系，然而對于差異表達(dá)基因的具體調(diào)控方式和通路作用機制目前還未知。

4 結(jié) 論

本研究以模式動物果蠅為實驗對象進(jìn)行二元雜交，利用RNA-seq對體重性狀雜種優(yōu)勢高低兩組分別進(jìn)行測序分析，初步探究雜種優(yōu)勢的分子機理，篩選出了與體重雜種優(yōu)勢相關(guān)的潛在候選基因和代謝通路，主要有糖代謝通路、脂代謝通路和氧化還原通路等。